一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法
【专利摘要】本发明提供一种利用木豆无菌苗叶片进行外植体转化，建立木豆毛状根培养体系方法。本发明采用叶片为外植体,建立毛状根培养体系：叶片在1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L的培养基上预培养两天后进行菌液侵染，菌液浓度OD600为0.6-0.8，侵染5-10min后转入1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L培养基上共培养3天，然后转入抑菌培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L+400mg/L羧苄青霉素，约一周左右便可形成毛状根。PCR检测证明外源基因已经转入到木豆毛状根中，转化率为60%。转化后毛状根在无激素培养基上生长速度非常快，一个月能增殖7-8倍。次生代谢产物含量高，芹菜素和染料木素含量分别为0.58mg/g(DW)和1.32mg/g(DW)，显著高于实生苗根中含量。本发明提供的培养简单、再生周期短、可持续获得木豆毛状根方法，可用于规模化培养木豆毛状根来提取有价值次生代谢产物，具有很好的应用前景。
【专利说明】一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法
【技术领域】:
[0001]本发明是一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，遗传转化率高且周期短，毛状根生长速度快，次生代谢产物含量高。本发明属于农业生物【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]木豆[Cajanuscajan (L.) Millspaugh],蝶形花科(Papilionaceae),木豆属(Cajanus)，是一种短期夏季生长的一年生豆类作物，因豆荚结于树冠枝梢上，故称木豆；鸽子爱吃，又称鸽豆；是世界第六大食用豆类，也是木豆属中唯一的一个栽培种。木豆的根、茎、叶、花、荚和种子都可以入药，全身是宝，除具有很高的经济、生态利用价值外，还具有显著的药用价值。
[0003]在木豆根的有效药用化学成分中，芹菜素和染料木素是主要的黄酮苷元成分，具有很好的药理活性。芹菜素具有抑制致癌物质活性，作为治疗HIV和其它病毒感染的抗病毒药物，具有低毒、无诱变性的特点。染料木素具有抗氧化作用，可以抑制酪氨基酸蛋白激酶(PTK)和拓扑异构酶II的活性，具有诱发细胞程序性死亡、提高抗癌药效、抑制血管生成等作用，是一种很有潜力的癌症化学预防剂，其抗癌作用及机制具有广泛的应用前景。
[0004]利用毛状根培养技术生产有价值的木豆次生代谢产物芹菜素和染料木素是一条经济有效的途径，毛状根具有生长迅速、生长和遗传稳定以及在无激素的培养基上生长等特点，它能够合成与 原植物含量相当或高于原植物含量的次生代谢产物，而且生产能力稳定，利于天然产物的开发和利用。因此利用发根农杆菌侵染木豆叶片，产生毛状根，并对毛状根进行继代增殖培养，可规模化生产芹菜素和染料木素，是木豆药用资源可持续发展的有效途径之一。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种遗传转化率高，毛状根生长速度快且次生代谢产物含量高的木豆毛状根遗传转化体系建立方法，为木豆有药用价值次生代谢产物生产源源不断地提供原料。该发明为利用毛状根培养规模化生产木豆有价值的次生代谢产物成分奠定基础。
[0006]本发明主要是涉及利用木豆无菌苗的叶片为外植体，利用发根农杆菌介导，建立木豆毛状根培养体系的方法。主要包括外源生长调节物质，培养基组成，预培养时间，共培养时间，菌液浓度，侵染时间等，建立快速高效的木豆毛状根培养体系。
[0007]具体的技术路线包括以下几方面内容:
[0008]1、木豆无菌苗的获得:
[0009]将灭菌后的木豆种子接种到MS+20g/L蔗糖+8g/L琼脂的培养基上培养，一个星期左右，木豆种子发芽，两周左右可获得木豆的无菌苗。
[0010]2、外植体转化
[0011]在超净工作台中，将木豆植株叶片剪成两端有伤口，约0.5cmX0.5cm大小，放在1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8.0g/L的培养基上，26°C暗培养，预培养2天后，将木豆叶片放进发根农杆菌LBA9402菌液(0D_为0.6-0.8)中浸染20min，用无菌滤纸吸去多余菌液，放在共培养培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8.0g/L上共培养3天。
[0012]3、外植体抑菌
[0013]共培养3天后，将木豆叶片转入含有400mg/L羧苄青霉素的1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8.0g/L培养基上抑菌，20天后将感染后长出的毛状根，从叶片上剪下，放到含有400mg/L羧苄青霉素的1/2MS培养基上培养，并观察毛状根的除菌情况，调整培养基中羧苄青霉素含量，直至毛状根除菌完全。
[0014]4、转化毛状根PCR检测
[0015]完全抑菌的毛状根经PCR检测表明，外源基因已经整合到毛状根体内，具有很高遗传转化率，遗传转化率为60%。
[0016]5、木豆毛状根次生代谢产物含量检测
[0017]采用HPLC法，对木豆毛状根次生代谢产物含量进行检测，木豆毛状根的芹菜素和染料木素的含量分别为0.58mg/g(Dff)和1.32mg/g(DW)，显著高于木豆实生苗中芹菜素和染料木素的含量，高出2倍之多。
[0018]6、木豆毛状根继代增殖培养
[0019]将上述获得的毛状根接种到无激素培养基1/2MS+蔗糖20g/L中进行继代增殖培养，毛状根生长速度快，保 持很高的增殖倍数，一个月能增殖7-8倍。
[0020]本发明所使用的培养基都是按照常规的方法处理的，pH值均为5.8-6.0，高温高压(121°C，1.5个大气压)20min后使用的。
[0021]本发明的培养室是在常规的组织培养室(温度25°C左右，光照1000-15001ux，光/暗周期16h/8h，湿度70%左右)中进行的。
[0022]本发明的技术特征:.[0023]I)以木豆无菌苗叶片为外植体建立了木豆毛状根培养体系。
[0024]2)木豆毛状根诱导所花费的时间短，仅需一周左右。
[0025]3)木豆毛状根生长速度快，次生代谢产物含量高。
[0026]4)可以为木豆有价值的次生代谢生产源源不断地提供原料。
【专利附图】
【附图说明】:
[0027]附图1木豆无菌苗叶片诱导毛状根
[0028]附图2继代培养基上生长木豆毛状根
[0029]附图3转化毛状根PCR检测，M，DL2000marker ;1，阳性对照(质粒DNA) ;2，阴性对照(非转化根)；3_6，转化不同毛状根无性系
[0030]附图4液体培养基培养木豆毛状根
【具体实施方式】:
[0031]1、木豆无菌苗的获得
[0032]在超净工作台中，将清洗干净的木豆种子用75%的酒精杀菌30s，然后用无菌水洗2遍，再用3%的次氯酸钠消毒2min，无菌水清洗3遍，滤纸吸干种子表面水分，接种到固体培养基上。培养条件为温度(25±1) °C，光照强度1500-20001UX，光周期16h/8h。一个星期左右，木豆种子发芽，两周左右可获得木豆的无菌苗。
[0033]2、外植体转化
[0034](I)外植体的准备
[0035]在超净工作台中，将木豆无菌苗叶片边缘剪掉，所剪叶片大小约为0.5cmX0.5cm。
[0036]( 2 )外植体预培养
[0037]将剪好的叶片培养在1/2MS+IBA0.2mg/L+20g/L蔗糖+琼脂8.0g/L的培养基上，25°C暗培养，预培养的时间设置为0，1，2，3及4天，研究发现，预培养2天可以得到较高的转化率，因此确立2天为木豆叶片外植体的预培养时间。
[0038](3)菌液浓度的确立
[0039]本发明所采用的发根农杆菌菌株为LBA9402，将菌株划线培养在YEP固体培养基上，28°C培养2天后，挑取单菌落接种到5mL YEP液体培养基中，160r/min震荡培养24h，取ImL菌液稀释50倍继续震荡培养至600nm处菌液吸光度值分别为0.2,04,0.6,0.8及1.0时，侵染预培养2天的叶片，当菌液OD6tltl值为0.6-0.8时，转化率较高。因此0D_的值为
0.6-0.8的菌液均可用于侵染。
[0040](4)菌液侵染时间的确立
[0041]在确立好菌液浓度的基础上，将预培养2天的叶片放进准备好的菌液(0D_的值为0.6-0.8)，设置不同的侵染时间:5min, IOmin, 15min，20min及25min。结果表明，在5min-20min内，随着侵染时间的延长,遗传转化率逐渐提高,在20min时达到最大值,超过20min,外植体褐化死亡。因此确立20min为最佳的菌液侵染时间。
[0042](5)共培养时间的确立
[0043]将侵染20min的叶片取出，用无菌滤纸吸去多余的菌液，叶面向轴面朝下放置在共培养培养基MS+IBA0.2mg/L+20g/L蔗糖+琼脂8.0g/L上，设置不同的共培养时间:1天，2天，3天，4天及5天。共培养3天的遗传转化率最高，因此最佳的共培养时间为3天。
[0044](6)外植体的抑菌
[0045]将共培养3天的外植体转入抑菌培养基，抑菌剂分别采用了头孢霉素和羧苄青霉素，发现头孢霉素对毛状根的诱导和生长有抑制作用，而羧苄青霉素不但抑菌效果好，而且毛状根的生长和诱导未受影响，因此本发明采用了羧苄青霉素作为抑菌剂，工作浓度为400mg/L。
[0046]3、木豆毛状根PCR检测
[0047]将外植体转入抑菌培养基后，大约一周左右，叶片的切口部位将会有毛状根出现(图1)，毛状根生长迅速，分枝多(图2)。在抑菌培养基培养一段时间无发根农杆菌残留后，将获得的毛状根进行PCR检测，PCR检测结果表明，发根农杆菌所携带的目的基因已经整合进木豆毛状根体内(图3)，遗传转化率为60%。
[0048]4、木豆毛状根液体继代增殖培养
[0049]将经PCR检测呈阳性，生长旺盛且分枝多的毛状根在液体继代增殖培养基MS+20g/L蔗糖进行继代增殖培养，木豆的毛状根生长速度快，一个月能增殖7-8倍(图4)。
[0050]5、木豆毛状根次生代谢产物含量检测
[0051]采用HPLC法对木豆毛状根的次生代谢产物含量进行检测，木豆毛状根中芹菜素的含量为0.58mg/g(Dff),染料木素的含量为1.32mg/g(Dff)，比木豆实生苗根中的含量高出
两倍之 多。
【权利要求】
1.一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，其特征在于: O采用木豆无菌苗叶片为外植体进行转化；2)确立了适合木豆遗传转化的预培养时间、菌液浓度、侵染时间及共培养时间；3)外植体抑菌培养抑菌剂选择；4)确立了最佳的预培养、共培养及继代增殖培养基；5)此转化程序具有很高的遗传转化率，毛状根生长速度快，次生代谢产物含量高。
2.根据权利要求1所述的一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，其主要特征在于:采用木豆无菌苗的叶片为外植体进行遗传转化，操作方便，可以避免外植体灭菌不彻底带来的污染，外植体易于获得，一个星期左右，便可以从叶片边缘诱导出毛状根，再生速度快。
3.根据权利要求1所述的一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，其主要特征在于:用于转化的叶片外植体预培养时间为2天，时间超过两天，转化假阳性比较多；侵染时菌液浓度0D_的值为0.6-0.8，菌液浓度低于0.6，木豆毛状根再生速度慢，遗传转化率低，菌液浓度大于0.8，外植体抑菌困难，外植体易褐化死亡，降低遗传转化率；最佳侵染时间为20min，侵染时间过短或过长，均不利于外植体遗传转化；转化外植体共培养时间为3天，共培养时间过长，发根农杆菌过度增殖，抑菌困难。
4.根据权利要求1所述的一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，其主要特征在于:共培养后，外植体转入抑菌培养基，所采用的抑菌剂为羧苄青霉素，羧苄青霉素不但抑菌效果好，而且毛状根的生长速度未受影响。
5.根据权利要求1所述的一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，外植体预培养及共培养的培养基为1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8.0g/L培养基，继代增殖的基本培养基为MS+蔗糖20 g/L。
6.根据权利要求1所述的一种高效的木豆毛状根培养体系建立方法，其主要特征在于:遗传转化率高，PCR检测证明，发根农杆菌Ti质粒所携带的目的基因已经整合进木豆毛状根体内，遗传转化率为60%，毛状根生长速度快且次生代谢产物含量高，一个月能增殖7-8倍，芹菜素和染料木素的含量分别为0.58mg/g(Dff)和1.32mg/g(Dff)。
【文档编号】A01H5/00GK104017822SQ201310190956
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2013年5月22日
【发明者】王慧梅, 付玉杰, 王文杰, 祖元刚, 曲丹, 任洁 申请人:东北林业大学, 王慧梅