专利名称：一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法
技术领域：
本发明涉及一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，属于农业生物技术领域或植物细胞工程领域。
背景技术：
我国是枣树的起源地和栽培中心，种质资源非常丰富。冬枣(Ziziphus jujuba Mill。)是鼠李科枣属植物，因果实成熟在寒露节后而得名。冬枣风味独特，产量高，是品质优良的一个鲜食栽培品种，在果树生产、贸易上具有重要的经济价值。沾化冬枣是冬枣中鲜食品质最好的品种之一，主产于山东省渤海湾地区，适合在中低度盐地生长，经济价值很高。然而，沾化冬枣存在果实偏小、果核大、果皮薄及耐贮性差等缺点，而且农户为追求产量，使用激素处理增大果实，极大的降低了沾化冬枣的优良品质。由于冬枣花小，雌雄蕊分离困难，落花落果严重，胚容易退化，到目前为止，冬枣育种工作基本上停留在田间品种选优，周期长和效率低下。
多倍化是植物进化变异的自然现象，也是促进植物发生进化改变的重要力量(杨继，2001)。被子植物中，约70％的种类在进化过程中发生过一次或多次多倍化(Masterson，1994)，这表明多倍化可以增强植物的适应性和竞争力。多倍体植株在形态上多表现营养器官和生殖器官的巨大性，适应性、抗逆性较强，此外次生代谢产物也因倍性变化而产生变化。对以收获营养器官为目的的果树来说多倍体果实在果实大小、品质、环境的适应性及抗逆性方面具有更大的优势，而且还可能表现无核或少核的优异性状，在生产和育种上具有重要经济价值(Stanford，1983)。二倍体玫瑰香葡萄利用秋水仙素得到的四倍体植株，不仅保持了二倍体的优良品种，而且增强了抗逆性，果实也显著增大，获得了极好的经济性状(罗耀武，1995)。秋水仙素诱导的同源四倍体金柑表现大果、无或少核的多倍体性状(李传生和张美珍，1988)。
有性多倍化是多倍体形成的主要路线，2n配子在多倍性形成中起着极其重要的作用。对于不能产生2n配子或仅能产生SDR(second division restitution)或PMD(Post-meitotic doubling)型配子的作物，体细胞染色体加倍是进行多倍化的理想途径(Stanford，1983)。前人研究认为适合染色体加倍的作物应具备染色体数目少、收获营养体为主、异花授粉及多年生和营养繁殖的特性(Dewey，1981)。自1937年Blakeslee和Avery利用秋水仙素诱导曼陀罗四倍体植株获得成功以后，秋水仙素在果树多倍体诱导方面的得到广泛应用，用来改良果实性状或诱导杂交亲本(Preieri，2001)。沾化冬枣多倍体诱导技术难度较大，主要是由于目前冬枣的组培体系效率较低，植株在培养基上生长缓慢。目前关于冬枣的离体培养体系报道较少，王玉珍(1999)和徐华陵(2003)以冬枣的茎尖和茎段为外植体培养，获得了再生植株，但繁殖效率不高。陈宗礼等(2002)以沾化冬枣叶片为外植体，诱导愈伤组织的产生，但愈伤组织分化率仅为40％。
枣利用秋水仙素处理进行染色体加倍的研究报道较少，严仁玲等(1996)用不同浓度的秋水仙素处理金丝小枣试管苗单芽茎段，促使不定芽染色体加倍，获得了同源四倍体株系。蒋洪恩等(2004)以冬枣、临猗梨枣和辣椒枣一年生嫁接苗为试材，以秋水仙碱为诱变剂诱导多倍体，但仅在临猗梨枣中获得一株纯化的四倍体植株。
目前报道获得的四倍体枣为金丝小枣和临猗梨枣，是与冬枣基因型完全不同的栽培品种，而且在所用处理材料类型、秋水仙素处理程序，培养基种类以及激素方面都有显著差异。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是，以冬枣茎尖和叶片为处理材料，利用离体培养体系，用秋水仙素诱导染色体加倍手段，建立一种冬枣多倍体诱导体系的方法，以选择获得同质四倍体植株。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用；其中，所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指将茎尖转入茎延伸培养基生长，将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长；所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃±2℃黑暗条件下，100rmp摇动24-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30-35天继代一次；所述小苗生根和移栽方法是指将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗，接种在生根培养基中，进行生根；当根长2cm-3cm时，移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中，前6-7天盖好封口膜，保持湿度为90％，20℃～25℃环境下，生长15-20天，之后移至室外土壤中生长，其间每2-3天浇一次1/2 MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次。
上述茎延伸培养基是指添加有1-3mg L-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；上述叶片诱导丛生芽培养基是指添加有0.5-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；上述生根培养基是指添加有0.1-0.5mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基；在上述培养基中涉及的激素浓度的优选量，因培养材料的基因型不同，可在所述用量范围内变动。
上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O0.025mg L-1，盐酸硫胺素10.0mg L-1，盐酸吡哆醇1.0mg L-1，烟酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0；该培养基主要用于冬枣茎尖培养和继代。
上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O96mg L-1，Ca(NO3)2556mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O22.3mg L-1，H3BO36.2mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，盐酸硫胺素1.6mg L-1，烟酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0；该培养基主要用于冬枣叶片离体培养。
上述Nithsh固体培养基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mgL-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，FeSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0；该培养基主要用于栽培苗的生根。
其中，MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指不添加所述的琼脂粉的配方；上述1/2 MS基本培养基无机盐溶液是指MS液体培养基无机盐成分含量的一半。
本发明中所述培养基及植物生长调节物质均热压灭菌；秋水仙素过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述冬枣是指鼠李科枣属植物的晚熟栽培枣品种(Zizyphus jujuba Mill)。
上述冬枣优选是沾化冬枣。
上述冬枣因在寒露节后成熟而得名，丰产稳产，适应性强，是鲜食优良枣品种。沾化冬枣是其中鲜食品质最好的品种之一，主产于我省渤海湾地区。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法优选是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.05％-0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。
上述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法最优选是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述茎延伸培养基优选是指添加有1-2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2-0.4mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；所述叶片诱导丛生芽培养基是指添加有1-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；所述生根培养基是指添加有0.2-0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3-0.6mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
上述茎延伸培养基最优选添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基。
上述叶片诱导丛生芽培养基最优选添加有1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mgL-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基。
在上述的秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法中，处理后植株的倍性鉴定采用流式细胞仪测定叶片DNA含量的方式，DNA含量是二倍体植株两倍的即为四倍体植株(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果，对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n＝2x＝24，而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n＝4x＝48(见图2)。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述生根培养基最优选添加有0.2mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述四倍体植株的嫁接方法优选是，选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在沾化冬枣大树或枣砧木上。处理中，按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜缠绕，上部用塑料袋罩住保湿，并注意遮阴。
本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法中，所述四倍体植株的特征表现为植株生长缓慢，茎粗壮，节间较短，叶形变圆，气孔密度和大小均与二倍体植株有显著性差异(见图3)。
利用本发明涉及的建立冬枣多倍体诱导体系的方法，以冬枣茎尖生长点和叶片为受体材料，采用秋水仙素处理诱导染色体加倍，建立了多倍体诱导体系，经选择获得同质四倍体植株，将在冬枣生产和育种上起重要作用。冬枣生长点不经脱分化过程直接出芽，具有基因型依赖性小、体细胞无性系变异小等优点，是合适的多倍体诱导材料。
本发明能获得大量的具有很强植株再生能力的组培苗，再生植株体细胞无性系变异小。本发明的特点在于1)大幅度减少基因型障碍，可诱导绝大多数基因型的冬枣快速产生大量离体茎尖；2)培养的冬枣茎尖生长点分裂旺盛，生长速度快，适于细胞学和分子生物学实验；3)取材不受季节限制；4)可以较高频率的诱导同质多倍体植株。
图1冬枣二倍体及四倍体植株的DNA含量其中A二倍体植株叶片的DNA含量，B四倍体植株叶片的DNA含量图2冬枣二倍体及四倍体植株的染色体数目其中A二倍体植株根尖染色体数目(2n＝2x＝24)，B四倍体植株叶片的DNA含量测定(2n＝4x＝48)图3冬枣二倍体及四倍体植株的气孔密度和大小其中A二倍体植株叶片气孔密度和大小；B四倍体植株叶片气孔密度和大小具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1沾化冬枣茎尖培养沾化冬枣是鲜食品质最好的冬枣品种之一，主产于我省渤海湾地区。沾化冬枣休眠芽在28℃，70％湿度的恒温培养箱中水培萌发。萌发的幼枝剪成单芽茎段，70％酒精杀菌30s，0.1％的升汞消毒8min，无菌水冲洗3-4次，然后接种在添加1mg L-1GA3和0.2mg L-16-BA的MS固体培养基上，35天继代一次。组织培养苗10-15天可生长2cm以上，生长点细胞处于旺盛分裂状态。
秋水仙素(Sigma，USA)添加在含有1mg L-1GA3和0.2mg L-1BA的MS液体培养基中，终浓度为0.1％。将细胞分裂旺盛的茎尖放于含有0.1％浓度秋水仙素的MS液体培养基中，25℃黑暗条件下，100rmp摇动48h。秋水仙素处理后的茎尖，无菌水冲洗2-3次，转入添加1mg L-1GA3和0.2mg L-16-BA的MS培养基中培养。
上述MS固体培养基(Murashige and Skoog)的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2 H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O0.025mg L-1，盐酸硫胺素10.0mg L-1，盐酸吡哆醇1.0mg L-1，烟酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0。
上述Nithsh固体培养基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mgL-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，FeSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0。
处理植株的倍性鉴定秋水仙素处理茎尖通过流式细胞仪测定叶片DNA含量，四倍体植株的DNA含量是二倍体植株的两倍(见图1)。细胞学观察结果验证了流式细胞仪的分析结果，对照二倍体的沾化冬枣根尖染色体数为2n＝2x＝24， 而四倍体沾化冬枣植株的根尖染色体数目为2n＝4x＝48(见图2)。
四倍体植株的生根和移栽对诱导的四倍体沾化冬枣组培苗接种在添加0.2mg L-1IAA和0.3mg L-1IBA的生根培养基中，进行生根。当根长2-3cm时，移入砂与蛭石1∶1的基质中，开始一周盖好封口膜，保持湿度在90％，温度为25℃。温室环境下生长15-16天后移至土壤中，每2-3天浇一次1/2MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次。
四倍体植株的嫁接选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在树龄10-15的沾化冬枣大树或枣砧木上，按常规嫁接方式处理砧木和接穗的切口，嫁接口用塑料薄膜缠绕，上部用塑料袋罩住保湿，并注意遮阴。
四倍体植株特征和应用四倍体植株生长缓慢，茎粗壮，节间较短，叶形变圆，二倍体与四倍体植株的气孔密度和大小均有显著性差异(见图3)。
实施例2具体方法如实施例1，其中，茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L-1GA3和0.3mg L-16-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为72小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
实施例3具体方法如实施例1，其中，茎延伸培养基激素浓度为2mg L-1GA3和0.4mg L-16-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为48小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L-1IAA和0.6mg L-1IBA。
实施例4具体方法如实施例1，茎延伸培养基激素浓度为1.5mg L-1GA3和0.3mg L-16-BA，秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为24h，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
实施例5具体方法如实施例1，其中，所处理材料为冬枣叶片，叶片WPM培养基激素浓度为1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L-1吲哚乙酸(IAA)。秋水仙素浓度为0.1％，处理时间为24小时，诱导获得了同质四倍体植株，生根培养基激素浓度为0.3mg L-1IAA和0.4mg L-1IBA。
上述WPM固体培养基(Woody plant medium)的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O96mg L-1，Ca(NO3)2556mg L-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O22.3mg L-1，H3BO36.2mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，盐酸硫胺素1.6mg L-1，烟酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0。
权利要求
1.一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用；其特征在于所述的冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养是指将茎尖转入茎延伸培养基生长，将叶片转入叶片诱导丛生芽培养基生长；所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.01％-0.2％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃±2℃黑暗条件下，100rmp摇动24-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30-35天继代一次；所述小苗生根和移栽方法是指将秋水仙素处理诱导后的四倍体冬枣组织培养苗，接种在生根培养基中，进行生根；当根长2-3cm时，移入砂∶蛭石的重量比为1∶1的基质中，前6-7天盖好封口膜，保持湿度为90％，20℃2～25℃环境下，生长15-20天，之后移至室外土壤中生长，其间每2-3天浇一次1/2MS培养基无机盐溶液，隔天浇水一次；上述茎延伸培养基是指添加有1-3mg L-1赤霉素(GA3)、0.1-0.5mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；上述叶片诱导丛生芽培养基是指添加有0.5-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.3-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和100-500mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；上述生根培养基是指添加有0.1-0.5mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.2-1mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基；上述MS固体培养基的配方是KNO31900mg L-1，NH4NO31650mg L-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 22.3mg L-1，H3BO310mg L-1，KI 0.83mg L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mg L-1，CuSO4·5H2O 0.025mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，盐酸硫胺素10.0mg L-1，盐酸吡哆醇1.0mg L-1，烟酸1.0mg L-1，甘氨酸2.0mg L-1，肌醇100.0mg L-1，生物素0.05mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH 6.0；上述WPM固体培养基的配方是NH4NO3400mg L-1，CaCl2·H2O 96mg L-1，Ca(NO3)2556mgL-1，MgSO4·7H2O 370mg L-1，K2SO49900mg L-1，KH2PO4·H2O 170mg L-1，FeSO4·7H2O 27.8mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 8.6mg L-1，MnSO4·H2O 22.3mg L-1，H3BO36.2mgL-1，Na2MoO4·2H2O 0.25mg L-1，CuSO4·5H2O 0.25mg L-1，盐酸硫胺素1.6mg L-1，烟酸0.5mg L-1，肌醇100.0mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH6.0；上述Nithsh固体培养基的配方是KNO3950mg L-1，NH4NO3720mg L-1，CaCl2·2H2O166mg L-1，MgSO4·7H2O 185mg L-1，KH2PO4·H2O 68mg L-1，FeSO4·7H2O 27.85mg L-1，EDTA·Na237.3mg L-1，ZnSO4·7H2O 10mg L-1，MnSO4·4H2O 25mg L-1，KI 10mg L-1，CoCl2·6H2O 0.025mg L-1，MoO30.25mg L-1，肌醇5000mg L-1，蔗糖30g L-1，琼脂粉6g L-1，pH6.0；其中，MS液体培养基、WPM液体培养基、Nithsh液体培养基的配方是指不添加所述的琼脂粉的配方；上述1/2MS培养基无机盐溶液是指MS液体培养基无机盐成分含量的一半。
2.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述冬枣是指鼠李科枣属植物晚熟的栽培品种(Zizyphus jujuba Mill)。
3.按照权利要求2所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述冬枣是沾化冬枣。
4.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.05-0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48-72小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。
5.按照权利要求4所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述秋水仙素处理冬枣茎尖生长点或叶片的方法是将长至5mm-6mm的冬枣细胞分裂旺盛的茎尖或叶片，放于含有质量体积百分比为0.1％的秋水仙素的MS液体培养基中，在25℃黑暗条件下，100rmp摇动48小时，之后，无菌水冲洗2-3次，茎尖转入茎延伸培养基中培养，叶片转入叶片诱导丛生芽培养基中培养，30天继代一次。
6.按照权利要求1、4或5所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述茎延伸培养基是指添加有1-2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2-0.4mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和300mg L-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；所述叶片诱导丛生芽培养基是指添加有1-2mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.5-1mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；所述生根培养基是指添加有0.2-0.3mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3-0.6mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
7.按照权利要求6所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述茎延伸培养基是指添加有2mg L-1赤霉素(GA3)、0.2mg L-16-苄基嘌呤(6-BA)和300mgL-1酪蛋白水解物的MS固体培养基；所述叶片诱导丛生芽培养基是指添加有1.3mg L-1噻二唑苯基脲(TDZ)、0.7mg L-1吲哚乙酸(IAA)和300mg L-1酪蛋白水解物的WPM固体培养基；所述生根培养基是指添加有0.2mg L-1吲哚乙酸(IAA)，0.3mg L-1吲哚丁酸(IBA)的Nitsh固体培养基。
8.按照权利要求1所述建立冬枣多倍体诱导体系的方法，其特征在于所述四倍体植株的嫁接方法是，选取生长健壮的四倍体组培苗和移栽苗，在5-6月份嫁接在沾化冬枣大树或枣砧木上。
全文摘要
本发明公开了一种建立冬枣多倍体诱导体系的方法，包括①冬枣细胞旺盛分裂的茎尖和叶片培养；②以冬枣茎尖生长点和叶片为处理材料，用秋水仙素处理进行染色体加倍；③小苗生根和移栽；④四倍体植株的嫁接；⑤四倍体植株的特征和应用等步骤。本发明以细胞分裂旺盛的茎尖和叶片为处理材料，能有效地克服基因型制约，获得同质多倍体植株的效率高，对具有重要经济价值的枣的遗传改良有重要价值。
文档编号A01G1/06GK1672498SQ200510043219
公开日2005年9月28日 申请日期2005年4月4日 优先权日2005年4月4日
发明者谷晓峰, 张举仁, 张可炜, 杨爱芳, 尹小燕 申请人:山东大学