一种多倍体金线莲有机培养一次性成苗诱导方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用植物金线莲染色体增加倍数后一次性成苗有机培养的方法，更具 体涉及我国传统珍贵药材兰科开唇兰属一种多年生草本植物野生金线莲植株无菌体系建 立及染色体增加倍数后多倍体一次性成苗有机培养的方法。
【背景技术】
[0002] 金线莲（Anoectochilus roxburghii (Wall.)Lindl)是传统的珍贵药材之一，属于 兰科（Orchidaceae)开唇兰属（Anoectochilus)植物，含糖类、牛磺酸、强心戒类、醋类、生 物碱、留体，多种氨基酸，微量元素及无机元素等，常用于治疗糖尿病、风湿性关节炎、肺热 咳嗽、破伤风、急慢性肝炎等。因其药用价值而深受人们的喜爱，市场需求量大增。近年来 自然环境遭受严重破坏和人为的大量掠夺性采摘，导致野生金线莲越来越少，加之金线莲 对生长环境要求苛刻，自然繁殖率低，商品价格居高不下。在金线莲生产上对优良品种选育 更新是一项亟待展开的工作。自然界中普遍存在多倍体植株，与二倍体植株相比，它们具有 优势性状，主要有植株营养器官如根、茎、叶等的巨大性，抗逆性增强，环境适应性强、生长 速率快，有机合成速率加快，有效药用成分增加。金线莲所有的营养器官都可药用，因而金 线莲多倍体育种具有重要实际应用价值。
[0003] 关于金线莲组织培养报道虽然很多，但是采用经过多倍体育种后一次性成苗有机 培养获多倍体植株方面未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种多倍体金线莲有机培养一次性成苗诱导方法，进行金 线莲多倍体诱导并进行产业化生产，为获得生态适应性强、药用成分含量高的金线莲多倍 体新品种和大量诱导多倍体植株提供技术支持。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案： (1) 无菌体系的建立 将采集的野生金线莲植株经消毒处理，接种到诱导培养基上建立无菌体系，诱导培养 基为 White+1. OmgL i-BA+O. 3mgL iNAA+O. 5mgL ΧΤ+Θ. 5gL 1 琼脂 +30gL 1 鹿糖 +2. OgL 1 活性 炭，pH5. 6-5. 7,培养条件：温度23±2°C，光照强度500-10001x，光照时间lOh/d ; (2) 多倍体诱导 选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金线莲组培瓶苗为试验材料，切取诱导的 无菌离体茎段，采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法或加入培养基法进行处理，然后接种于多 倍体一次性成苗培养基中培养；培养条件：培养室温度为23±2°C，先暗培养10天，10天后 光照逐渐增强，光照时间10h/d，30天后光照强度控制在1500-20001x，光照时间12h/d;多 倍体一次性成苗培养基：White+蛋白胨2g/L+花宝2号lg/L + 土豆100g/L+鹿糖3%+琼 脂0. 65%+活性炭0. 2% ; (3) 增殖培养：将步骤（2)得到的生长良好的多倍体金线莲植株瓶苗剪取切成l-2cm带 节茎段，接种在多倍体一次性成苗培养基中增殖培养； (4)移栽：将经过4-5个月增殖培养的多倍体金线莲植株瓶苗，置自然光下炼苗5-7 天，打开瓶盖炼苗1-2天；然后用摄子从培养瓶中取出栽培瓶苗，洗去附着在根系上的培 养基，移入混合基质中，放置在温度15~30°C、湿度75%~85%、避免阳光直射环境下 种植，获得多倍体金线莲植株健壮完整种苗。
[0006] 步骤（4)中所述混合基质为质量比4: 1 :1的泥炭土 +粉碎杉木皮+珍珠岩的混 合基质。
[0007] 步骤（2)所述秋水仙素溶液浸泡法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5 个月培养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成l-2cm带节茎段，放入经过高压灭 菌的浓度为300-500mg/L的秋水仙素溶液中浸泡24-60h，将浸泡处理后的材料在超净工作 台上用无菌水冲3-4遍，接种于多倍体一次性成苗培养基中培养。
[0008] 步骤（2)所述涂抹法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5个月培养的金 线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成l_2cm带节茎段，在超净工作台中用无菌棉签蘸 上经过高压灭菌的300-700mg/L秋水仙素溶液，然后用蘸上秋水仙素溶液的棉签涂抹在莖 节处，再将涂抹过秋水仙素的材料接种到多倍体一次性成苗培养基中培养。
[0009] 步骤（2)所述加入培养基法的具体步骤为：选取健壮、生长一致的经过4-5个月培 养的金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成l_2cm带节莖段，接种到添加300-700mg/ L秋水仙素溶液的多倍体一次性成苗培养基上，培养15-30天，然后转入多倍体一次性成苗 培养基中继续培养。
[0010] 本发明应用多倍体一次性成苗培养基培养多倍体栽培瓶苗，诱导率高，变异植株 成活率高。该技术瓶苗培养周期短(培养4-5个月后直接移栽)、扩繁系数高（每个茎段平均 增殖8. 77个芽）、栽培适应性强、茎粗直径（4-5_)、根系多（4-6根)且发达、韧性强，纤维含 量高，病虫害少，植株活力强，叶片颜色深厚，绒布状明显，叶脉金线明晰，缓苗速度快（7-10 天)，成活率达99%以上，生根率达99%，每株重量达3. 5-5. 5克，内物质含量高。
【附图说明】
[0011] 图1 :茎段诱导。
[0012] 图2:多倍体瓶苗1。
[0013] 图3:多倍体瓶苗2。
[0014] 图4:多倍体瓶苗移栽。
[0015] 图5:成活状态苗1。
[0016] 图6:成活状态苗2。
[0017] 图7:采收。
[0018] 图8 :100倍下二倍体植株气。
[0019] 图9 :100倍四倍体植株气孔。
[0020] 图10 :400倍下二倍体植株气孔大小。 图11 :400倍下四倍体植株气孔大小。
[0021] 图12 :二倍体染色体数。
[0022] 图13:四倍体染色体数。
【具体实施方式】
[0023] 1多倍体材料的来源 1. 1无菌体系的建立 用金线莲茎段作为外植体，将野外采回金线莲植株用洗涤剂漂洗材料表面，再置于流 水中冲滴0. 5-lh后用双蒸水冲洗2-3次，置超净工作台上用75%酒精消毒30s，倒去酒 精，加入0. 1%升汞（HgCl2)处理10-12min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲3-4遍后，用消毒 滤纸吸干接种材料表面水分，取出要接种材料放在灭过菌的培养皿，接种到诱导培养基上 建立无菌体系。诱导培养基为 White+1. OmgL h-BA+O. 3mgL WAA+O. 5mgL ^Τ+θ. 5gL 1 琼脂 +3(^171蔗糖+2. OgL-1活性炭，ρΗ5· 6-5. 7,培养条件：温度23±2°C，光照强度500-10001x， 光照时间l〇h/d。
[0024] 1 · 2多倍体诱导的取材方法 选取健壮生长一致经过4-5个月培养金线莲组培瓶苗为试验材料，切取诱导的无菌 离体茎段，接种在添加300-500mg/L秋水仙素溶液的继代培养基上，培养10-30天后转入 不含秋水仙素的继代培养基中继续培养；或切取初代诱导的无菌离体茎段，用经过高压灭 菌300-500mg/L秋水仙素溶液浸泡24-60h后，用无菌水冲3-4遍后，接种在不含秋水仙 素的继代培养基上培养。继代培养基为White+3. OrngLl-BA+O. Smgl^NAA+O. Smgl^KT+e· SgL-1琼脂+30gL ―1蔗糖+2. OgL ―1活性炭，pH5. 6-5. 7,培养条件为温度23±2°C，光照强度 1500-20001X，光照时间10h/d。培养20天后，经过秋水仙素处理的无菌茎段部分长出新生 芽，外观与对照芽差异显著。培养4个月后待苗长出根后，切取根尖做染色体检测。
[0025] 1.3多倍体的染色体鉴定 切取根尖生长点，先置于4°C的冰箱中预处理8-24h，接着用卡诺氏固定液(冰乙酸：乙 醇=1:3)在室温下固定18-24h，用蒸馏水漂洗后，在90%、80%、70%的酒精各浸泡30min，再 用蒸馏水漂洗后，用Im0Ir1Hcl溶液在60°C水浴中解离处理10_30min，解离好的根尖用蒸 馏水洗净，将其用改良的苯酚品红溶液中染色3-5分钟，压片，将压好的片子置于显微镜下 镜检观察即可。
[0026] 2试验方法 2. 1增加倍数诱导方法 本发明采用秋水仙素溶液浸泡法、涂抹法、加入培养基法三种方法进行多倍体诱导试 验，每种方法均设置了若干组处理时间和浓度梯度，研宄不同取材(茎段、茎尖)、不同处理 方法、不同浓度秋水仙素及不同处理时间对多倍体诱导率的影响。
[0027] 2. L 1秋水仙素溶液浸泡法 选取生长一致健壮的经过5个月培养金线莲组培瓶苗，在无菌条件下，将瓶苗切成 l-2cm带节茎段，放入经过高压灭菌的浓度为300mg/L、500mg/L、700mg/L秋水仙素溶液分 别浸泡10、20、30、40