专利名称：一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法，主要用于药用金线莲的组 织培养。
技术背景金线莲[^7oectoc/ iJ"s rox/wrg力ii 6raW. J "/7c7]为兰科开唇兰属多年生草本，别名 金蚕、金线兰、金线虎头蕉等，是我国传统珍贵药材，素有"金草"、"神药"、"乌人参"等 美称，在民间应用范围较广，广泛应用于风湿性关节炎、高血压、糖尿病、肾病等疑难杂症 的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面，尤其在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视 为珍稀名贵药材，特别在台湾省更是倍受青睐，被称为"药中之王"。近年来，随着对其药效 学和临床应用研究的深入，对金线莲药用价值的认识进一步提高，其市场货源紧缺的状况更 为严峻。金线莲种子微小，由未成熟的，J及数层种皮细胞构成，自然萌发率和繁殖率低，生产上 的种苗均来自组织培养。目前，金线莲的组培育苗主要通过"不定芽的诱导、芽增殖与壮苗 培养"三个阶段来实现，培养时间较长、成本较高，造成金线莲生产一直得不到较快的发展。 因此，如何縮短培养时间、提高培养效率、降低培养成本已成为促进金线莲生产发展的当务 之急。 发明内容本发明的目的是提供一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案包括如下步骤1) 培养基准备(1) 配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)2mg、 a -萘乙酸(NAA) 1.0 1.5mg、芸苔素内酯0.05mg、香蕉100g、琼脂6. 5g和蔗糖25g， pH值调节至5.6;(2) 分装将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中， 每瓶约50ml，稍凉后加盖；(3) 灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121°C 、 105kPa 下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；2) 外植体处理和接种该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三 步，其中清洗选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用 流水冲洗2小时；消毒在无菌条件(水平超净工作台)下，去除叶片，将植株茎段在75%的酒精中浸润10 秒后，放入10%的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中 备用；接种将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于 准备好的培养基上，每瓶接l个茎段；当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切 成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接l个茎段；3) 培养将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为温度25土2'C，光 照时间每天12小时，光照强度1500 20001x，培养时间四个月，培养期间要勤检査，发现 污染的要及时去除；4) 移栽选苗高约6 8cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2 3条的试管苗，炼苗4天 后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土 + 2份粗砂(粗2 3mm) + 1份木屑，或1份菜园土+1份粗砂+ 2份木屑的基质中，3个月后植株成活率达95%以上， 且植株挺拔、生长良好。本发明通过合理调节激素用量及相互间的配比，促进金线莲幼苗的诱导与的生长，培 养四个月后，其增殖率达4.8倍，且组培苗色绿、叶多、根壮，生长良好。移栽结果也表 明， 一步培养成的组培苗符合生产所需，可作为金线莲生产种苗的重要来源。
具体实施方式
1、方法和步骤实例药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法实施例包括如下步骤1) 培养基准备①配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-BA2mg、 NAA1. Omg或l. 5mg、 芸苔素内酯0.05mg、香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g， pH调节至5. 6;②分装将配制后的培 养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，每瓶约50ml，稍凉后加盖； ③灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为12rC、 105kPa 下灭菌15min，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。2) 外植体处理和接种该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中清洗选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用 流水冲洗2小时；消毒在无菌条件(水平超净工作台)下，去除叶片，将植株茎段在75%的酒精中浸润10 秒后，放入10%的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中 备用；接种将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接l个茎段。当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接l个茎段。3)培养①将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养。培养条件为温度(25士2。C)，光照时间12h/d，光照强度1500 20001x;培养时间四个月；②培养期间要勤检査，发现污染的要及时去除。5)移栽选苗高约6 8cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2 3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土 + 2份粗砂(粗2 3mm) +1份木屑，或1份菜园土 +粗砂1份+木屑2份的基质中，3个月后植株成活率达95%以上，且植株挺拔、生长良好。实施例l1) 培养基准备(1) 配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-BA2mg、 NAA1. Omg、芸苔素内酯0, 05mg、 香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g，以上物质混合后的培养基的pH值调节至5.6;(2) 分装将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中， 每瓶约50ml，稍凉后加盖；(3) 灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121°C 、 105kPa 下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。2) 外植体处理(1) 清洗选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后 用流水冲洗2小时；(2) 消毒在无菌条件(水平超净工作台)下，去除叶片，将植株茎段在75%的酒精中浸 润10秒后，放入10%的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养 皿中备用。3) 接种将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约lcm、含一个茎节的若千茎段，接种于准备好 的培养基上，每瓶接l个茎段；4) 培养(1) 将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养；(2) 培养条件为:温度(25士2'C)，光照时间12h/d，光照强度1500 20001x;培养 时间四个月；(3) 培养期间要勤检査，发现污染的要及时去除。5) 移栽选苗高大于6cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2 3条的试管苗，炼苗4天 后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土 + 2份粗砂(粗2 3mm) + 1份木屑的基质中。实施结果培养四个月后，平均成苗数4.3株，组培苗平均株高6.2cm、平均叶净增 3.4张、平均发根数2.6条、平均鲜重净增517.5mg。移栽3个月后，植株成活率96.4%， 成活植株挺拔、生长良好。 实施例21) 培养基准备(1) 配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-BA2mg、 NAA 1. 5mg、芸苔素内酯0. 05mg、 香蕉100g、琼脂6. 5g和蔗糖25g， pH调节至5.6;(2) 分装将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中， 每瓶约50ml，稍凉后加盖；(3) 灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为12rC、105kPa 下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。2) 外植体处理(1) 清洗选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2小时；(2) 消毒在无菌条件(水平超净工作台)下，去除叶片，将植株茎段在75%的酒精中浸 润10秒后，放入10%的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养 皿中备用。3) 接种将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接l个茎段；4) 培养(1) 将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养；(2) 培养条件为温度(25士2。C)，光照时间12h/d，光照强度1500 20001x;培养 时间四个月；(3) 培养期间要勤检査，发现污染的要及时去除。5) 移栽选苗高约6 8cm、茎基直径约2mra、发根2 3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在 植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土 + 1份粗砂(粗2 3mm) +2份木屑的 基质中。实施结果培养四个月后，平均成苗数4.7株，组培苗平均株高6.5cm、平均叶净增 3.6张、平均发根数2.4条、平均鲜重净增536.4mg。移栽3个月后，植株成活率97.0%， 且植株挺拔、生长良好。 实施例31) 培养基准备 —(1) 配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-BA2mg、 NAA 1. 5mg、芸苔素内酯0. 05mg、 香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g， pH调节至5.6;(2) 分装将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，乘热均匀地分装于干净的培养瓶中， 每瓶约50ml，稍凉后加盖；(3) 灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为1'21'C 、 105kPa 下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。2) 外植体选择生长较为健壮组培无菌苗(植株)作为外植体。3) 接种在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约lcm、含一个茎节的若干茎段，接种于 准备好的培养基上，每瓶接l个茎段。4) 培养(1) 将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养；(2) 培养条件为温度(25土2。C)，光照时间12h/d，光照强度1500 20001x;培养 时间四个月；(3) 培养期间要勤检査，发现污染的要及时去除。5)移栽选苗高约6 7cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2 3条的试管苗，炼苗4天 后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土+2份粗砂+ 1份木屑， 或1份菜园土+粗砂1份(粗2 3鹏)+2份木屑的基质中。实施结果培养四个月后，平均成苗数4.2株，组培苗平均株高6. lcm、平均叶净增3.2 张、平均发根数2.3条、平均鲜重净增505.8mg。移栽3个月后，植株成活率96.1%，且植株挺 拔、生长良好。2、试验2.1激素对金线莲一步成苗影响的试验采用生长健壮的无菌组培苗植株作为外植体，以1/2Ms为基本培养基，添加香蕉10%、 琼脂O. 65%和蔗糖2.5%，激素添加量分别为6-BA2 3. Omg/L、 NAAO. 0 1. 5mg/L、芸苔素 内酯0.00 0.05mg/L，共16个处理，pH调节至5.6。将外植体在无菌条件下去叶后，茎段 切成长约lcm、含一个茎节的若干小茎段，分别接种在16个培养基上，每瓶接一个小茎段， 每处理接20瓶，重复三次。培养条件为温度(25土2。C)，光照时间12h/d，光照强度1500 20001x。培养期间 每隔10d观察一次生长情况，培养时间四个月考察、测定成苗数、新增叶片数、发根数和 鲜重净增量。2. 2移栽试验选苗高约6 8cm、茎基直径约2mra、丛生根有2 3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附 着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移入9种不同的种植基质中，考察不同基持对金线 莲组培苗成活率的影响。移栽前，试验基质均用45%多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浇透消毒。试验条件为遮荫度80%的阴棚，保持空气相对湿度的80 90%。如发现有病死植株，及 时拔除。每处理100株，重复三次。移栽3个月后考查成活株数，并进行分析。3、 结果与分析3.1激素对金线莲一步成苗影响的试验结果分析激素种类与配比对金线莲组培一步成苗结果存在明显的影响。从表l可以看出，6-BA 对金线莲芽的萌发具有较好的促进作用，但只加6-BA的情况下，成苗率较低、叶片及发根 数少，且生长差；NAA对发叶、发根有利，在添加1.0mg/L与1.5mg/L的情况下，新增叶片、 发根数和鲜重净增量均好于其它处理；芸苔素内酯0.05mg/L能明显促进植株生长。最适宜 的激素添加配比为6-BA2mg/L、 NAA1. Omg/L或1. 5mg/L、芸苔素内酯0. 05mg/L，培养四个 月后的平均成苗数4. 8株、平均叶净增3. 6张、平均发根数2. 5条、平均鲜重净增525. 6mg。表l激素对金线莲一步成苗的影响序号激素添加量(mg/U平均发芽 数(株)平均净增 叶(片)平均发根 数(条)平均鲜重 净增(mg)综合评价6-BA陽芸苔素内酯12.0—-3.711.010.65342.4差22.0_0. 053.691.211.30427.6差32.00.5-4.032.371.43386.5差42.00.50. 054.603.351.76498.5良2.01.0_4.863.402.13470.1差62.01. 00. 054.973.642.68564.6优2.01. 5-4.723.782.50516.3良82.01. 50. 054.783.692.72551.2优93.0——5.620.630.42312.5差103.0—0. 055.750.920.77405.8差113.00.5-5.082.271.56425.6差123.00.50. 055.133.452.37436.1差13 3.01.0—4.923.352.39464.5差143.01.00.054.853.502.43543.4良153.01. 5-4.903.422.33470.7差163,01. 50. 054.673.532.54521.2良3.2移栽试验结果分析表2为金线莲组培苗移栽3个月后的植株成活情况。从表中可以看出，处理6和处理9 保持96. 0%以上的成活率；处理7和处理8的植株成活率在80%左右，处理1的成活率最低， 仅为46.6%。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率，适宜 添加的比例为1份菜园土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混匀。表2种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响处理移栽数平均成活株数:平均成活率综合种植基质号(株)(株)1 ( 评价1菜园土30014046.6差2菜园土1份+粗砂1份(2--3mm、下同)30018561.6差3菜园土l份+粗砂2份3002331 77. 7差4菜园土1份+木屑1份3001771 59.0差5菜园土l份+木屑2份3002031 67. 7差6菜园土l份+粗砂2份+木屑l份30029598.3优菜园土l份+粗砂2份+木屑2份3002581 86.0良8菜园土1份+粗砂1份+木屑1份300242i 80. 7良9菜园土l份+粗砂l份+木屑2份3002891 96.3优
权利要求
1、一种药用金线莲组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤1)培养基准备该步骤包括配制，分装，灭菌三步，其中配制以1/2MS为基本培养基，每升添加6-苄氨基嘌呤2mg、α-萘乙酸1.0～1.5mg、芸苔素内酯0.05mg、香蕉100g、琼脂6.5g和蔗糖25g，混合后的培养基的pH值调节至5.6；分装将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；灭菌将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121℃、105kPa下灭菌15分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；2)外植体处理和接种该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中清洗选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗2小时；消毒在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在75％的酒精中浸润10秒后，放入10％的次氯酸钠消毒15分钟，用无菌水清洗6遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；接种将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约1cm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接1个茎段；当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约1cm、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接1个茎段；3)培养该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为温度25±2℃，光照时间每天12小时，光照强度1500～2000lx，培养时间四个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；4)移栽选苗高约6～8cm、具叶3张以上、茎基直径约2mm、发根2～3条的试管苗，炼苗4天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至1份菜园土+2份粗砂+1份木屑，或1份菜园土+1份粗砂+2份木屑的基质中。
全文摘要
本发明公开了一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法，主要包括1)培养基准备，该步骤包括配制，分装，灭菌三步；2)外植体处理和接种，该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步；当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种；3)培养；4)移栽。本发明以自然生长或组培继代培养产生的金线莲植株中间茎段为外植体，在无菌条件下将含有一个茎节的茎段接种于培养基上，结果表明最适宜的培养基经过四个月的培养后，每个外植体平均成苗数4.8株，每株平均叶净增3.6张、平均发根数2.5条、平均鲜重净增525.6mg。组培苗移栽至基质中生长良好，3个月后植株成活率达95％以上。本发明可大大缩短金线莲组培成苗时间，显著提高培养效率，降低育苗成本，可作为金线莲种苗生产的重要方法。
文档编号A01H4/00GK101213942SQ20081005923
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者任江剑, 俞旭平, 徐建中, 江建铭, 沈宇峰, 沈晓霞, 王志安 申请人:浙江省中药研究所有限公司