专利名称：利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养扩繁方法
技术领域：
本发明属于药用植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖，从而获得优质种苗的方法。
背景技术：
金线莲(Anoecthilus roxburghii)为兰科开唇兰属多年生草本植物,别名为金线兰、金丝草、树草莲、金线虎头蕉等。通常生长在荫蔽阔叶林下的肥沃腐叶土中，是我国传统的珍贵药材，有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛的功效，且无毒副作用，在民间素有“药王”的美誉。金线莲株高8 20cm，株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色、呈网状排列，又是观赏价值极高的室内观叶珍品。金线莲种子微小，胚发育不完全，在自然条件下极难出芽；若以分根或扦插繁殖，则耗时长且繁殖系数低，金线莲赖以生存的自然环境发生变化，野生资源锐减，加之长期采挖，种质资源稀缺，已濒临灭绝，已不能满足临床需求。野生金线莲干货最高曾涨到每公斤3000多元。应用植物组培快繁方法在一定程度上解决了金线莲种苗短缺的现象，有关金线莲的快速繁殖技术国内多有报道。但是，应用植物组培的方法生产金线莲种苗，消耗大量的人力、物力，生产成本居高不下，且培养周期长，种苗质量不高，仍不能满足药农的需求。利用间歇浸没培养反应器成功进行其它植物培养的研究已有报道。在中国专利文献CN101720668B中，公开了一种利用间歇浸没式间歇浸没培养系统进行甘蔗组织培养快繁的方法，其利用间歇浸没培养反应器对三个品种的甘蔗培养进行了介绍。在中国专利文献CN101213942A中披露了一种药用金线莲组织培养一步成苗快速繁殖方法，但是培养时间过长，效率低下。一方面由 于不同间歇浸没培养装置的操作方法不同，上述专利文献中所使用的培养装置和本专利不同；另一方面由于各种植物生理、生化上的不同，相同的培养方法对不同的植物培养不一样，需要不同的培养条件和处理方式，并不能通过简单的有限次实验推理来得到。上述文献专利中提及的步骤以及其中涉及到的具体的培养方式和培养条件完全不能用于利用间歇浸没生物反应器培育金线莲。应用间歇浸没生物反应器进行金线莲种苗的生产可以弥补传统方法生产的缺陷，为低成本的生产高质量的金线莲种苗提供了有效的方法。鉴于利用间歇浸没式培养方法进行金线莲种苗的生产未见报道和公开应用，因此，有必要研究出一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种周期短、成本低、操作简单的金线莲种苗生产方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快繁的方法包括准备工作、外植体选择与无菌处理、接种、生物反应器培养，具体地，该方法包括以下步骤:
(O前期准备
培养液配制:MS液体为基本培养液，添加激素NAA0.2^1.5mg/L ；激素6-BA
0.5^2.5mg/L ;蔗糖浓度30g/L ;金线莲0.Γ .0g/L ;培养液配制完成后，放入三角瓶中，高温高压湿热灭菌后备用；
反应器灭菌:将反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用；
(2)外植体选择与无菌处理
当外植体为自然生长的植株时，需要对茎无菌处理；
当外植体为无菌组培苗时，直接进行接种；
(3)接种
无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的反应器中；
当外植体为自然生长的植株时，将无菌处理过的茎除去叶片后切成每个含一个茎节的若干茎段，首先接种到MS固体培养基中，经过3飞天的观察培养，无菌后接种到上述反应器中；
当外植体为无菌组培苗时，除去叶片同样将茎切成每个含一个茎节的若干茎段，直接接种到上述反应器中；
反应器接种密度35 80个茎段/L ；
(4)生物反应器培养
设定间歇浸没反应器的参数:浸没频率:3 15minATl2h，优选5 10 min/8 10h ;培养时间为60 120d。设定培养环境条件为:光照强度150(Tl8001UX，光照12 h/d，温度25±1°C。作为本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)前期准备中，所述激素ΝΑΑ0.5 1.0mg/L,激素 6-BA 1.(Tl.5 mg/L,金线莲 0.2 0.5 g/L,调整 PH 值 5.8 6.2 ;所述步骤(3)接种中，反应器接种密度45飞O个茎段/L ;所述步骤(4)生物反应器培养中的培养时间为8(T90d。通过大量的实验证实，培养液中适宜的金线莲添加量为0.2^0.5 g/L,当培养液中金线莲添加量低于0.2 g/L时，获得的金线莲组培苗和普通培养获得的组培苗长势并没有显著差异，组培苗叶片长、株高、茎粗等小于添加量在0.2^0.5 g/L时获得的组培苗，且差异显著；当金线莲添加量高于0.5 g/L时，随着添加量的增加组培苗并没有显著地变化。通过一组实验证实，反应器培养金线莲适宜的接种密度是45飞O个茎段/L，当接种量低于45个茎段/L时，组培苗没有充满整个反应器，空间利用率低；当接种量高于60个茎段/L时，反应器中组培苗拥挤，出现了畸形苗。作为本发明进一步的改进在于，所述步骤(I)前期准备中，培养液中添加金线莲
汁液。金线莲汁液中含有金线莲生长过程中所不可缺少而又无法人工合成的微量元素，经
过大量的实验证明，添加金线莲汁液的培养液比普通培养液培养获得的金线莲组培苗更健
壮。以普通培养液为对照，培养30天后比较金线莲组培苗长势情况如下表:
权利要求
1.一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，包括如下步骤: (1)前期准备 培养液配制:MS液体为基本培养液，添加激素NAA0.2^1.5mg/L ；激素6-BA0.5 2.5mg/L ;蔗糖浓度30g/L ;金线莲0.Γ .0g/L ;调整PH值5.8 6.2，培养液配制完成后，放入三角瓶中，高温高压湿热灭菌后备用； 反应器灭菌:将反应器包扎，高温高压湿热灭菌后备用； (2)外植体选择与无菌处理 当外植体为自然生长的植株时，需要对茎无菌处理； 当外植体为无菌组培苗时，直接进行接种； (3)接种 无菌环境中，将已灭菌的培养液倒入已灭菌的反应器中； 当外植体为自然生长的植株时，将无菌处理过的茎除去叶片后切成每个含一个茎节的若干茎段，首先接种到MS固体培养基中，经过3飞天的观察培养，无菌后接种到上述反应器中； 当外植体为无菌组培苗时，除去叶片同样将茎切成每个含一个茎节的若干茎段，直接接种到上述反应器中； 反应器接种密度35 80个茎段/L ； (4)生物反应器培养 设定间歇浸没反应器的参数:浸没频率:3 15minATl2h，优选5 10 min/8 10h ;培养时间为60 120d ； 设定培养环境条件为:光照强度150(Tl8001ux，光照12h/d，温度25±1°C。
2.根据权利要求1所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤(I)前期准备中，所述激素NAA0.5^1.0mg/L，激素6-BA1.(Tl.5mg/L，金线莲0.2 0.5g/L ;所述步骤(3)接种中，反应器接种密度45飞O个茎段/L ;所述步骤(4)生物反应器培养中的培养时间为8(T90d。
3.根据权利要求1或2所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，所述步骤(I)前期准备中，培养液中添加金线莲汁液。
4.根据权利要求3所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，金线莲汁液的制备方法是鲜物研磨和/或榨汁。
5.根据权利要求3所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，使用叶片和/或根制备金线莲汁液。
6.根据权利要求1或2所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，当外植体为自然生长的植株时，无菌处理的方法分为清洗和消毒。
7.根据权利要求6所述的利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，所述清洗的方法为:选择生长健康无病害的植株，去除根部，用高锰酸钾溶液浸泡5 10min，然后流水清洗3(T60min ;所述消毒的方法为:在无菌环境中，将上述清洗后的植株去除叶片，用75%的酒精浸泡茎15 30s，无菌水清洗2次后，再用0.1%的升汞浸泡l(T20min，无菌水清洗5 7次。
全文摘要
本发明属于中药材领域，具体涉及一种利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养扩繁的方法，该方法包括前期准备、外植体选择与无菌处理、接种、生物反应器培养等步骤，并在反应器中一次性完成增殖与生根壮苗培养，具有周期短、组培苗质量高等特点，为金线莲的组织培养快速繁殖提供了一种低成本、高效率的方法。
文档编号A01H4/00GK103120126SQ20131004318
公开日2013年5月29日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者陈集双, 张本厚, 贾明良, 金磊磊 申请人:南京工业大学