峨眉金线莲的组培快繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种可提高移栽成活率和增殖系数，并且可以保持峨眉金线莲优良性状和药性的金线莲组培快繁方法，属于植物组织培养【技术领域】。该方法先选取生长在5～10月份的野生峨眉金线莲，制作外植体并进行消毒处理，然后通过丛生芽的诱导、继代培养、生根壮苗培养和移栽温室大棚培养的措施，通过激素诱导使金线莲快速繁殖。本发明方法，可以保持峨眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单、成本低，可以实现工厂化育苗。采用本方法诱导出丛生芽并生根的比例达90%以上，移栽成活率在95%以上，在4个月内增殖系数可以达到8-10倍。通过本发明方法生产的峨眉金线莲，不变异，产量高，成本低，周期短，具较强的市场竞争力。
【专利说明】峨眉金线莲的组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养【技术领域】，具体涉及一种可提高移栽成活率和增殖系数，并且可以保持蛾眉金线莲优良性状和药性的金线莲组培快繁方法。
【背景技术】 [0002]蛾眉金线莲(AnoectochilusemeiensisK.Y.Lang.)是兰科(Orchidaceae)、开唇兰属(Anoectochilus)多年生草本植物，同花叶开唇兰、台湾金线莲、福建金线莲等统称为金线莲。在民间常作药用，其氨基酸组成、成分、含量及维生素、多糖等含量均高于西洋参和野山参。其性平味甘，具有清热、凉血、祛风利湿、强心利尿、固肾平肝以及降血压等功效，在治疗肝病、高血压、糖尿病及肿瘤等方面有良好的效果。另外，金线莲也是观赏价值极高的观赏植物。
[0003]但是，由于金线莲属植物的种子微小，不具胚乳，无发芽能力，只有与真菌共生的情况下才能萌发，因此，发芽率低，野外生长条件苛刻，自然繁殖和生长缓慢。另外由于蛾眉金线莲的生境地破坏严重，野生蛾眉金线莲资源非常稀少，现已濒临灭绝。
[0004]为此研究蛾眉金线莲的人工培养技术，建立一套种苗的组织培养快繁体系，对合理保护开发蛾眉金线莲资源并实现产业化、规模化有着十分重要的作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种可提高移栽成活率和增殖系数的蛾眉金线莲组培快繁方法，使种苗生产能满足规模生产的需要。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:蛾眉金线莲的组培快繁方法，包括如下步骤:
[0007]a、选取生长在5~10月份的蛾眉野生金线莲，除去根和叶，将茎切成带腋芽或顶芽的段状作为外植体材料，外植体进行消毒处理；
[0008]b、丛生芽的诱导:将消毒后的外植体接种到诱导培养基进行培养；诱导培养基为:MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值为 5.6 ~6.0 ;培养周期为 30 ~40 天；
[0009]C、继代培养；
[0010]d、生根壮苗培养；
[0011]e、移栽温室大棚培养。
[0012]其中，在具体实施时，步骤a中外植体的长度为0.5cm比较合适。继代培养次数5~10次比较合适。
[0013]其中，上述方法步骤c中继代培养所采用的培养基与步骤b中所述诱导培养基相同。
[0014]其中，上述方法步骤d中生根壮苗培养的培养基为:1/2MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂 6 ~10g/L + 活性炭 1.5 ~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6-BA, pH 值为 5.6 ~6.0。
[0015]其中，上述方法步骤d中生根壮苗培养的培养基为:1/2MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6_BA，pH 值为 5.8。
[0016]其中，上述方法步骤b中诱导培养基为:MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂8g/L +活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6-BA + 0.5mg/LNAA, pH 值为 5.8。
[0017]其中，上述方法步骤e移栽温室大棚培养是指生根壮苗培养后，炼苗7天，组培苗长至4~5cm高时移栽至人工大棚，移栽用介质为泥炭土加少量珍珠岩的混合物。
[0018]其中，上述方法步骤a所述消毒处理是指将外植体用自来水冲洗2~3小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗，置超净工作台内，75%酒精浸泡30秒，无菌水清洗干净，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，无菌水清洗4-5次，每次2分钟。
[0019]其中，上述方法步骤b、c和d都在培养室进行培养，培养室条件为:光照强度为20001ux, 16h/d,培养温度为22~25°C ;每两个月对培养室定期消毒。
[0020]其中，上述方法步骤e所述温室大棚采用透光率50%遮荫网遮荫，温室大棚中温度控制在20~32°C，相对湿度控制在65~75%。
[0021]其中，上述方法步骤a中所述金线莲是指生长在蛾眉山地区的蛾眉金线莲。
[0022]本发明的有益效果是:本发明是通过激素诱导蛾眉金线莲的腋芽或顶芽产生丛生芽进行快速繁殖来实现的，通过对培养基的筛选，发现了特别适合蛾眉金线莲种苗培育的培养基，增殖系数(即增殖倍数`)达8-10倍，移栽成活率在95%以上，以此可实现商品化规模种植。
[0023]本发明组培快速繁殖的方法，可以保持蛾眉金线莲的优良性状，保持其优良的药性，且方法简单易行，生产成本低，不污染环境，可以实现工厂化育苗。采用本方法诱导出丛生芽并生根的比例达90%以上，移栽成活率在95%以上，在4个月内增殖系数可以达到8-10倍。通过本发明方法生产的蛾眉金线莲，不变异，产量高，成本低，周期短，具较强的市场竞争力。
【具体实施方式】
[0024]本发明具体可以按照以下方式实施，蛾眉金线莲的组培快繁方法，包括如下步骤:
[0025]a、选取生长在5~10月份的野生蛾眉金线莲，除去根和叶，将茎切成带腋芽或顶芽的段状作为外植体材料，外植体用自来水冲洗2~3小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗，置超净工作台内，75%酒精浸泡30秒，无菌水清洗干净，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，无菌水清洗4-5次，每次2分钟；
[0026]b、丛生芽的诱导:将消毒后的外植体接种到诱导培养基进行培养；诱导培养基为:MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值为 5.6 ~6.0 ;培养周期为 30 ~40 天；
[0027]C、继代培养5~10次；培养基为:MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂6~IOg/L + 活性炭 1.5 ~2.5g/L + I ~2mg/L6-BA + 0.3 ~0.7mg/LNAA, pH 值为 5.6 ~6.0 ;培养周期为30~40天；
[0028]d、生根壮苗培养；培养基为:1/2MS培养基+蔗糖25~35g/L+琼脂6~10g/L +活性炭 1.5 ~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6_BA，pH 值为 5.6 ~6.0 ;[0029]e、移栽温室大棚培养:生根壮苗培养后，炼苗7天，组培苗长至4~5cm高时移栽至人工大棚，移栽用介质为泥炭土加少量珍珠岩的混合物。
[0030]本发明所述的MS培养基即为常规的MS培养基或常规方法配制的MS培养基。1/2MS培养基:无机盐为MS培养基的一半。本领域技术人员可以理解的是，本发明步骤b、c和d采用的培养基都是通过基础培养基(MS培养基或1/2MS培养基)配加蔗糖、琼脂、活性炭等配制得到，上述各物质的含量都是配制完成后各物质质量所占总体积的含量。其中，琼脂是以藻类的石花菜属(Gelidium)及江蓠属(Gracilaria)制成的胶产品，为培养基的固化剂。6-BA即是6-苄氨基腺嘌呤，分子式:C12H11N5。NAA即是萘乙酸，英文通用名1-naphthlceticacid,其他名称 a_ 蔡乙酸。
[0031]优选的，上述方法步骤d中生根壮苗培养的培养基为:1/2MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6_BA，pH 值为 5.8。
[0032]优选的，上述方法步骤b和c采用的培养基为:MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂8g/L + 活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6-BA + 0.5mg/LNAA, pH 值为 5.8。
[0033]其中，上述方法步骤b、c和d都在培养室进行培养，优选培养室条件为:光照强度为20001ux，16h/d,培养温度为22~25°C ;每两个月对培养室定期消毒。
[0034]优选的，上述方法步骤e所述温室大棚采用透光率50%遮荫网遮荫，温室大棚中温度控制在20~32°C，相对湿度控制在65~75%。
[0035]下面通过实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的说明，但并不因此将本发明的保护范围限制在实施例之中。
[0036]实施例一
[0037]材料蛾眉金线莲，采自四川蛾眉山。按以下步骤繁殖蛾眉金线莲。
[0038]1、取野生蛾眉金线莲植株，切下长0.5cm含有一个腋芽的小段。
[0039]2、自来水冲洗2-3小时，软毛刷清洗干净，蒸馏水冲洗干净，置超净工作台内，75%酒精浸泡30秒，无菌水清洗干净，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，无菌水清洗4-5次，每次2分钟。
[0040]3、消毒后的外植体接种到诱导培养基进行培养；诱导培养基为:MS培养基+蔗糖 30g/L+ 琼脂 8g/L+ 活性炭 2.0g/L+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA, pH 值为 5.8 ;培养周期为30-40天；培养条件为:光照强度为20001ux，16h/d,培养温度为22_25°C。培养7天左右开始萌发，当丛生芽萌发至0.5cm长时，将其剖开，转接至继代培养基上，继代培养基成分及培养条件同丛生芽诱导，2个月后增殖系数为3-4。
[0041]4、当丛生芽长至Icm长时，单株转接到生根壮苗培养基进行培养，生根壮苗培养基成分为:1/2MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+活性炭2.0g/L+0.5mg/LNAA+0.2mg/L6-BA, pH值为5.8 ;培养条件同丛生芽诱导(光照强度为20001ux，16h/d，培养温度为22-250C )。生根培养50-60天，生根率可达95%以上，长4_5cm左右。
[0042]5、炼苗7天后移栽至人工大棚，大棚50%遮荫网遮荫，培养基质为泥炭土加少量珍珠岩的混合物。移栽后每天浇水3次，浇至培养基质湿透为止(使植株周围湿度70%左右)，每半月施复合肥一次(常见蔬菜专用肥:氮15%、五氧化二磷7%和氧化钾8%)，并注意防治病虫害。[0043]本次繁殖得到的蛾眉金线莲在4-5个月内通过丛生芽的诱导及继代、生根壮苗等步骤，诱导出丛生芽并生根的比例达90%以上，移栽后成活率在95%以上，在4个多月内增殖系数可达8-10，长5cm左右，且通过本实施例生产的蛾眉金线莲，不变异，产量高，成本低，大大提高了蛾眉金线莲的数量。
[0044]实施例二
[0045]材料蛾眉金线莲，采自四川蛾眉山。按以下步骤繁殖蛾眉金线莲。
[0046]1、取野生蛾眉金线莲植株，切下长0.5cm含有一个顶芽的小段。
[0047]2、自来水冲洗2-3小时，软毛刷清洗干净，蒸馏水冲洗干净，置超净工作台内，75%酒精浸泡30秒，无菌水清洗干净，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，无菌水清洗4-5次，每次2分钟。
[0048]3、消毒后的外植体接种到诱导培养基进行培养；诱导培养基为:MS培养基+蔗糖 30g/L+ 琼脂 8g/L+ 活性炭 2.0g/L+1.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA, pH 值为 5.8 ;培养周期为30-40天；培养条件为:光照强度为20001ux，16h/d,培养温度为22_25°C。培养7天左右开始萌发，当丛生芽萌发诱导产生2-4个左右并约有0.5cm长的新芽时，将其剖开，转接至继代培养基上，继代培养基成分及培养条件同丛生芽诱导，2个月后增殖系数为3-4。
[0049]4、当丛生芽长至Icm长时，单株转接到生根壮苗培养基进行培养，生根壮苗培养基成分为:1/2MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+活性炭2.0g/L+0.5mg/LNAA+0.2mg/L6-BA, pH值为5.8 ;培 养条件同丛生芽诱导(光照强度为20001ux，16h/d，培养温度为22-250C )。生根培养50-60天，生根率可达95%以上，长4_5cm左右。
[0050]5、炼苗7天后移栽至人工大棚，大棚50%遮荫网遮荫，培养基质为泥炭土加少量珍珠岩的混合物。移栽后每天浇水3次，浇至培养基质湿透为止(使植株周围湿度70%左右)，每半月施复合肥一次(常见蔬菜专用肥:氮15%、五氧化二磷7%和氧化钾8%)，并注意防治病虫害。
[0051]本次繁殖得到的蛾眉金线莲在4-5个月内通过丛生芽的诱导及继代、生根壮苗等步骤，诱导出丛生芽并生根的比例达90%以上，移栽后成活率在95%以上，在4-5个月内增殖系数可以达到8-10倍。且通过本实施例生产的蛾眉金线莲，不变异，产量高，成本低，大大提高了蛾眉金线莲的育苗生产能力。
【权利要求】
1.蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于包括如下步骤: a、选取生长在5~10月份的野生蛾眉金线莲，除去根和叶，将茎切成带腋芽或顶芽的段状作为外植体材料，外植体进行消毒处理； b、丛生芽的诱导:将消毒后的外植体接种到诱导培养基进行培养；诱导培养基为:MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + I~2mg/L6_BA +0.3~0.7mg/LNAA, pH值为5.6~6.0 ;培养周期为30~40天； C、继代培养； d、生根壮苗培养； e、移栽温室大棚培养。
2.根据权利要求1所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤c中继代培养所采用的培养基与步骤b中所述诱导培养基相同。
3.根据权利要求1所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤d中生根壮苗培养的培养基为:1/2MS培养基+蔗糖25~35g/L +琼脂6~10g/L +活性炭1.5~2.5g/L + 0.3 ~0.7mg/LNAA + 0.15 ~0.25mg/L6_BA，pH 值为 5.6 ~6.0。
4.根据权利要求3所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤d中生根壮苗培养的培养基为:1/2MS培养基+蔗糖30g/L +琼脂8g/L +活性炭2.0g/L + 0.5mg/LNAA + 0.2mg/L6-BA, pH 值为 5.8。
5.根据权利要求1所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤b中诱导培养基为=MS 培养基+ 蔗糖 30g/L +琼脂 8g/L + 活性炭 2.0g/L + 1.5mg/L6_BA + 0.5mg/LNAA, pH 值为 5.8。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤e移栽温室大棚培养是指生根壮苗培养后，炼苗7天，组培苗长至4~5cm高时移栽至人工大棚，移栽用介质为泥炭土加少量珍珠岩的混合物。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤a所述消毒处理是指将外植体用自来水冲洗2~3小时，然后用软毛刷清洗，用蒸馏水冲洗，置超净工作台内，75%酒精浸泡30秒，无菌水清洗干净，0.1%的升汞溶液中表面消毒15分钟，无菌水清洗4-5次，每次2分钟。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤b、c和d都在培养室进行培养，培养室条件为:光照强度为20001uX，16h/d,培养温度为22~25°C ;每两个月对培养室定期消毒。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的蛾眉金线莲的组培快繁方法，其特征在于:步骤e所述温室大棚采用透光率50%遮荫网遮荫，温室大棚中温度控制在20~32°C，相对湿度控制在65~75%。
【文档编号】A01H4/00GK103688854SQ201310655251
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】鲁松, 熊铁一 申请人:四川省自然资源科学研究院, 峨眉山生物资源实验站