一种四倍体金线莲的培育方法
【专利摘要】一种四倍体金线莲的培育方法，本发明包括金线莲（Anoectochilusroxburghii）人工授粉、非共生萌发、诱变剂处理、壮苗培养和试管苗移栽等各阶段。金线莲开花后采取人工方法授粉，将成熟的金线莲蒴果经消毒后切开把种胚接种到萌发培养基上培养形成原球茎，然后转入含有诱变剂的液体分化培养基进行诱变处理，再接种到壮苗培养基进行壮苗培养，最后进行试管苗移栽。本发明简单易行，诱变频率达到75%以上，同时也可大幅度提高金线莲的药材产量，为金线莲多倍体育种、遗传改良和新品种培育开辟了一条新途径。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物新品种的培育方法，具体地说，涉及一种四倍体金线莲的培育方 法。 一种四倍体金线莲的培育方法
【背景技术】
[0002] 金线莲riar/wrgAii)，即花叶开唇兰，另lj名金线莲、金石松、虎头 蕉、鸟人参等，为兰科开唇兰属珍稀药用植物。金线莲是我国传统珍贵药材，由于其治疗面 广、疗效独特，有"神药"之称，享有"药王"等美誉。
[0003] 染色体是决定生物个体性状基因的载体，染色体加倍以后的植株与亲本之间会产 生形态及性状上的变化，其中巨大性是多倍体最为显著的外部形态特征。与此同时，植物染 色体倍性的变化也往往会导致次生代谢产物含量变化。中药材是一类具有特殊用途的经济 植物，一般以其根、茎、叶等器官为收获对象。多倍体植物中的染色体加倍，往往表现出植株 的巨大性，能较好地满足中药生产的需求。金线莲植株矮小、生长慢、生境苛刻，若能将其培 育为多倍体并固定下来，则可能提高其药用价值，同时为选育优质金线莲提供珍贵的原始 材料。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种四倍体金线莲的培育方法，通过人工授粉、非共生萌 发、诱变剂处理、壮苗培养和试管苗移栽等各阶段，以秋水仙碱和氟乐灵混合液作为多倍体 诱变剂处理金线莲类原球茎，提高了诱变率，处理一次即可获得数量可观的四倍体金线莲， 从而实现了本发明的目的。
[0005] 本发明的一种四倍体金线莲的培育方法，包括以下的步骤： (1)人工授粉：按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的金线莲植株作为亲本，在金 线莲开花后进行异花授粉。
[0006] (2)非共生萌发：在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，经75%?80%的酒 精溶液消毒2?5分钟后,用无菌水冲洗2?5次后置于0. 1%升萊溶液消毒8?15分钟， 经无菌水冲洗2?5次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开， 用接种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养20?30天后种子萌发成原球茎。
[0007] (3)诱变剂处理：将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基 中，在25?28°C条件下进行间歇振荡诱变处理240?480小时。
[0008] (4)壮苗培养：将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形 成5?8cm高的带根小苗。
[0009] (5)试管苗移栽：将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗 从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（1 :3)混合成的基质中并按常 规的二倍体金线莲进行大田栽培管理。
[0010] 上述（2)?（4)各步骤中的培养条件均为：培养温度25?30°C，每天光照10? 15小时，光照强度1500?20001x。
[0011] 上述步骤（2)所述的萌发培养基为：0. 5?2. Og/L花宝1号+0. 2?2. Og/L蛋白 胨+100?200ml/L椰子汁+20?35g/L蔗糖+3. 0?7. Og/L琼脂+0· 3?1. Og/L活性炭， 其余为MS培养基的有机物成分，pH为5. 4?5. 8 ; 上述步骤（3)所述的液体分化培养基为：l/2MS+0. 2?1. 2mg/L 6-BA+0. 1?0. 6mg/L NAA+20?35g/L蔗糖+0· 2?2. Og/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+0· 3?1. 0g/ L活性炭，pH为5. 4?5. 8; 上述步骤（3)所述的诱变剂为0. 01%?0. 05%秋水仙碱（olchicine) +0. 01%?0. 03% 氟乐灵（trifluralin)的混合液； 上述步骤（4)所述的壮苗培养基为：0. 5?2. 0g/L花宝1号+0. 5?2. 0g/L花宝2号 +0· 5?L 5mg/LNAA+0. 2?2. 0g/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗 糖+3. 0?7. 0g/L琼脂+0. 3?1. 0g/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，pH为5. 4? 5. 8 ； 上述步骤（5)所述的试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为2n=80的试管苗。
[0012] 本发明具有的特点，目前国内关于金线莲多倍体离体诱导有少量报道，但技术还 不够成熟，而本发明具有简单、易行、诱变率高的特点。本发明处理一次即可获得数量可观 的四倍体金线莲，可以为金线莲遗传育种提供亲本材料，也为金线莲的新品种培育提供新 的思路。
【具体实施方式】
[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0014] 实施例1 1、 品种来源 福建产组培苗经大田栽培2年后的优质金线莲； 2、 培育过程 (1)人工授粉：按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后120天蒴果成 熟。
[0015] (2)非共生萌发：在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经75%的酒精溶液消毒 3分钟后，用无菌水冲洗2次后置于0. 1%升汞溶液消毒8分钟，经无菌水冲洗2次后用无菌 滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到萌 发培养基上培养，培养23天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为：1. 5g/L花宝1 号+1. 0g/L蛋白胨+200ml/L椰子汁+25g/L蔗糖+4. 5g/L琼脂+0. 5g/L活性炭，其余为MS 培养基的有机物成分，pH为5. 6。
[0016] (3)诱变剂处理：将非共生萌发开成的原球茎转入含有0. 02%秋水仙碱和0. 01%氟 乐灵混合液的液体分化培养基中，在28°C条件下进行间歇振荡诱变处理240小时，经染色 体计数，四倍体诱导率为72%。所采用的液体分化培养基为：1/2MS+1. 2mg/L 6-BA+O. 4mg/L NAA+25g/L蔗糖+1. 0g/L蛋白胨+0. 5g/L酸性水解酪蛋白+0. 3g/L活性炭，pH为5. 6。
[0017] (4)壮苗培养：将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形 成5?8cm高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为：1. 0g/L花宝1号+1. 0g/L花宝2号 +0· 5mg/LNAA+2. Og/L 蛋白胨 +0· 5g/L 酸性水解酪蛋白 +35g/L 蔗糖 +3. Og/L 琼脂 +1. Og/L 活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，pH为5. 6. (5)试管苗移栽：将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶 中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（1 :3)混合成的基质中并按常规的二倍 体金线莲进行大田栽培管理，四倍体金线莲成活率达92%。
[0018] 上述（2)?（4)各步骤中的培养条件均为：培养温度28°C，每天光照13小时，光照 强度 15001x。
[0019] 实施例二 1、 品种来源 台湾产组培苗经大田栽培1年后的优质金线莲； 2、 培育过程 (1)人工授粉：按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后110天蒴果成 熟。
[0020] (2)非共生萌发：在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经78%的酒精溶液消毒 2分钟后，用无菌水冲洗5次后置于0. 1%升汞溶液消毒10分钟，经无菌水冲洗3次后用无 菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接种针将黄色种胚接种到 萌发培养基上培养，培养25天后种子萌发成原球茎。所采用的萌发培养基为：1. Og/L花宝 1号+2. Og/L蛋白胨+100ml/L椰子汁+25g/L蔗糖+6. Og/L琼脂+0. 3g/L活性炭，其余为 MS培养基的有机物成分，pH为5. 8。
[0021] (3)诱变剂处理：将非共生萌发开成的原球茎转入含有0. 01%秋水仙碱和0. 03%氟 乐灵混合液的液体分化培养基中，在25°C条件下进行间歇振荡诱变处理360小时，经染色 体计数，四倍体诱导率为74%。所采用的液体分化培养基为：l/2MS+0. 4mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+25g/L蔗糖+2. 0g/L蛋白胨+0. 5g/L酸性水解酪蛋白+0. 5g/L活性炭，pH为5. 8。
[0022] (4)壮苗培养：将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形 成5?8cm高的带根小苗。所采用的壮苗培养基为：1.5g/L花宝1号+1. 0g/L花宝2号 +1. 5mg/LNAA+l. 0g/L 蛋白胨 +0· 3g/L 酸性水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖 +3. 0g/L 琼脂 +1. 0g/L 活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，pH为5. 8. (5)试管苗移栽：将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶 中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（1 :3)混合成的基质中并按常规的二倍 体金线莲进行大田栽培管理，四倍体金线莲成活率达95%。
[0023] 上述（2)?（4)各步骤中的培养条件均为：培养温度25°C，每天光照10小时，光照 强度 20001x。
[0024] 实施例三 1、 品种来源 广西产组培苗经大田栽培1. 5年后的优质金线莲； 2、 培育过程 (1)人工授粉：按常规方法进行栽培管理，金线莲开花进行异花授粉后95天蒴果成熟。
[0025] (2)非共生萌发：在金线莲蒴果发育基本成熟而未开裂时，经80%的酒精溶液消毒 4分钟后，用无菌水冲洗3次后置于0. 1%升汞溶液消毒15分钟，经无菌水冲洗5次后用无
【权利要求】
1. 一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 人工授粉：按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的金线莲植株作为亲本，在金 线莲开花后进行异花授粉； (2) 非共生萌发：在金线莲蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，经75%?80%的酒精溶 液消毒2?5分钟后，用无菌水冲洗2?5次后置于0. 1%升汞溶液消毒8?15分钟，经无 菌水冲洗2?5次后用无菌滤纸吸干，然后用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，用接 种针将黄色种胚接种到萌发培养基上培养，培养20?30天后种子萌发成原球茎； (3) 诱变剂处理：将非共生萌发开成的原球茎转入含有诱变剂的液体分化培养基中，在 25?28°C条件下进行间歇振荡诱变处理240?480小时； (4) 壮苗培养：将经诱变处理的金线莲原球茎接种到壮苗培养基上培养，进一步形成 5?8cm高的带根小苗； (5) 试管苗移栽：将培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培 养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土和松树皮（1 :3)混合成的基质中并按常规的 二倍体金线莲进行大田栽培管理； 上述（2)?（4)各步骤中的培养条件均为：培养温度25?30°C，每天光照10?15小 时，光照强度1500?20001x。
2. 根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（2)所述 的萌发培养基为：〇. 5?2. Og/L花宝1号+0. 2?2. Og/L蛋白胨+100?200ml/L椰子汁 +20?35g/L蔗糖+3. 0?7. Og/L琼脂+0. 3?1. Og/L活性炭，其余为MS培养基的有机物 成分，pH为5. 4?5. 8。
3. 根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（3)所述 的液体分化培养基为：l/2MS+0. 2 ?1. 2mg/L 6-BA+0. 1 ?0. 6mg/L NAA+20 ?35g/L 蔗糖 +0· 2?2. Og/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+0· 3?1. Og/L活性炭，pH为5. 4? 5. 8〇
4. 根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（3)所述的 诱变剂为 〇· 01% ?〇· 05% 秋水仙碱（olchicine)+0· 01% ?0· 03% 氟乐灵（trifluralin)的 混合液。
5. 根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（4)所述的 壮苗培养基为：〇· 5?2. 0g/L花宝1号+0· 5?2. 0g/L花宝2号+0· 5?1. 5mg/LNAA+0. 2? 2. 0g/L蛋白胨+0· 1?0· 5g/L酸性水解酪蛋白+20?35g/L蔗糖+3. 0?7. 0g/L琼脂 +0. 3?1. 0g/L活性炭，其余为MS培养基的有机物成分，pH为5. 4?5. 8。
6. 根据权利要求1所述的一种四倍体金线莲的培育方法，其特征在于步骤（5)所述的 试管苗为经染色体计数后选取染色体数目为2n=80的试管苗。
【文档编号】A01H1/02GK104082123SQ201410297284
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月28日 优先权日:2014年6月28日
【发明者】梁钧淞, 莫昭展, 甘耀坤, 梁林英, 梁晓菊, 潘洁明, 严翠琼, 张燕飞, 吴凤娟 申请人:玉林师范学院