一种金线莲种质资源的低温保存方法
【专利说明】一种金线莲种质资源的低温保存方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于植物保存技术领域，具体涉及一种金线莲种质资源的低温保存方法。
【背景技术】
[0003]金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药。它在民间使用范围较广，素有“药王”、“金草”、“神药”、“乌人参”等美称。经有关部门测定发现，金丝莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性微量元素的含量均高于国产和野生西洋参。几百年来作为民间常用草药。功能与主治:清热凉血，除湿解毒，平衡阴阳、扶正固本，阴阳互补、生津养颜、调和气血、五脏、养寿延年的功用。入肾、心、肺三经，能全面提高人体免疫力，增强人体对疾病的抵抗力。主治肺热咳嗽，肺结核咯血，尿血，小儿惊风，破伤风，肾炎水肿，风湿痹痛，跌打损伤，毒蛇咬伤、支气管炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、急慢性肝炎、风湿性关节炎肿瘤等疑难病症。
[0004]近几十年来，由于该药具有神奇的疗效，鲜品价格不菲，药农、村民在原生地过筛样滥采，如今野生金线莲几近灭绝；由于金线莲种子胚高度发育不全，自然繁殖力极低，且仅分布于我国广西等五省区，宜生环境狭窄。因此，如何保护金线莲种质资源成为非常紧迫的课题。目前，人们对金线莲的研究仅限于快速繁殖、药用成分等方面，而对金线莲种质资源的保存技术未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了更好地保护金线莲这一珍贵的药用资源，保护生物的多样性，经过长期的研究实践，发明了一种能长期保存金线莲种质资源的方法，该方法具有成本低，操作简易，实用性强的优点。本发明所使用的技术方案为:
一种金线莲种质资源的低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)野生种苗的采集:到原生境采集生长健壮、无病虫害的金线莲植株；
2)原料处理:将采集的野生种苗清洗干净，晾干水分后，用3_5g/L的灭菌洗衣粉液浸泡20-30分钟后，将其冲洗干净后晾干水分，进行高温钝化；
3)无菌操作:切取种苗的茎尖或茎段进行灭菌处理，转入金线莲初代培养基，所述的金线莲初代培养基包括MS、6-BA、ZT、2，4-D、NAA、蔗糖和琼脂，培养基pH为5.5-6.0；
4)第一阶段，即第1-12个月，将无菌操作后的种苗进行低温诱导分化；
5)第二阶段，即第13-60个月，将分化后的种苗进行低温、暗处理；
6)第三阶段，即第61-72个月，将种苗转入金线莲继代培养基，所述的金线莲继代培养基包括MS、6-BA、ZT、NAA、蔗糖和琼脂，培养基的pH为5.5-6.0，将其置于常温、光照下培养；
7)第四阶段，即第73-96个月，将种苗转入低温、暗处理； 8)第五阶段，即第97-120个月，再将种苗转入金线莲培养基中，所述的金线莲培养基包括MS、6-BA、ZT、NAA、蔗糖和琼脂，培养基的pH为5.5-6.0，置于常温、光照下培养。
[0006]以上所述的步骤2)中高温钝化的温度为35-45°C，钝化时间为10-12小时。
[0007]以上所述的步骤3)灭菌处理具体步骤为将种苗的茎尖或茎段用70%乙醇浸泡1-5分钟后，用无菌水冲洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5-10分钟后，用无菌水冲洗2次，最后用
0.4%HgCL2浸泡3-7分钟后，无菌水冲洗2次后，将茎尖或茎段剪去叶片转入金线莲初代培养基中。
[0008]以上所述的步骤3)金线莲初代培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA l-5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-2.5mg/L、蔗糖30_45g/L和琼脂 5.5-6.5g/L。
[0009]以上所述的步骤4)低温诱导分化温度为2-8°C。
[0010]以上所述的步骤5)和7)低温、暗处理，温度控制在2-7 0C。
[0011]以上所述的步骤6)金线莲继代培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA l-5mg/L、ZT I.5-5.5mg/、NAA 0.5-1.5mg/L、蔗糖30_45g/L和琼脂5.5-6.5g/L。
[0012]以上所述的步骤8)金线莲培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA 0.5-5.5mg/L、ZT I.5-6.5mg/L、NAA 0.5-1.0mg/L、蔗糖30_45g/L和琼脂5.5-6.5g/L。
[0013]以上，所述的步骤6)和8)常温、光照，温度控制为15-30°C，光照强度为3000—3500lux。
[0014]本发明通过对金线莲组培苗进行低温、常温、黑暗、光照和不同培养基等条件的交替处理，利用外部条件驱动，低温诱使细胞分裂分化减慢，延缓了细胞再分化的时间，从而达到长期保存种质资源的目的。此外，本发明还具有以下优点:
1、方法易操作:金线莲种质资源保存10年间只转3次培养基，中途无需添加营养液，延长继代时间间隔，极大地降低生产成本，提高工作效率。
[0015]2、实用性强:占用极小的空间就能保存较多的种质资源。
[0016]3、不用冷冻防护剂DMSO处理，简单可靠，存活率高，能确保遗传的稳定性，很好地解决了金线莲低温保存技术。
[0017]4、此方法为保存其它珍稀植物资源提供了极具价值的研究思路和实验方法。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
一种金线莲种质资源的低温保存方法，包括以下步骤:
1)野生种苗的采集:到原生境采集生长健壮、无病虫害的金线莲植株；
2)原料处理:将采集的野生种苗清洗干净，晾干水分后，用3-5g/L的灭菌洗衣粉液浸泡20-30分钟后，将其冲洗干净后晾干水分，在温度为35-45°C进行钝化10-12小时；
3)无菌操作:切取种苗的茎尖或茎段，将种苗的茎尖或茎段用70%乙醇浸泡1-5分钟后，用无菌水冲洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5-10分钟后，用无菌水冲洗2次，最后用0.4%HgCL2浸泡3-7分钟后，无菌水冲洗2次后，将茎尖或茎段剪去叶片转入金线莲初代培养基中，所述的金线莲初代培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA l-5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、2，4-D 0.5-2.0mg/L、NAA 0.5-2.5mg/L、蔗糖30_45g/L和琼脂5.5-6.5g/L，培养基 pH 为 5.5-6.0;
4)第一阶段，即第1-12个月，将无菌操作后的茎尖或茎段在温度为2-8°C进行低温诱导分化；
5)第二阶段，即第13-60个月，将分化后的种苗进行低温、暗处理，温度控制在2-7°C，得种苗；
6)第三阶段，即第61-72个月，将种苗转入金线莲继代培养基，所述的金线莲继代培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA l-5mg/L、ZT I.5-5.5mg/、NAA
0.5-1.5mg/L、蔗糖30-45g/L和琼脂5.5-6.5g/L，培养基的pH为5.5-6.0，将其置于温度为15-30°C，光照强度为3000—3500 Iux条件下培养；
7)第四阶段，即第73-96个月，将种苗转入低温、暗处理，温度控制在2-7°C;
8)第五阶段，即第97-120个月，再将种苗转入金线莲培养基中，所述的金线莲培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA 0.5-5.5mg/L、ZT 1.5-6.5mg/L、NAA
0.5-1.0mg/L、蔗糖30-45g/L和琼脂5.5-6.5g/L，培养基的pH为5.5-6.0,将其置于温度为15-300C，光照强度为3000—3500 Iux条件下培养。
[0019]实施例2
一种金线莲种质资源的低温保存方法，包括以下步骤:
1)野生种苗的采集:到原生境采集生长健壮、无病虫害的金线莲植株；
2)原料处理:将采集的野生种苗清洗干净，晾干水分后，用3g/L的灭菌洗衣粉液浸泡30分钟后，将其冲洗干净后晾干水分，在温度为35 °C进行钝化12小时；
3)无菌操作:切取种苗的茎尖或茎段，将种苗的茎尖或茎段用70%乙醇浸泡I分钟后，用无菌水冲洗I次，再用10% H202浸泡浸泡5分钟后，用无菌水冲洗2次，最后用0.4%HgCL2浸泡3分钟后，无菌水冲洗2次后，将茎尖或茎段剪去叶片转入金线莲初代培养基中，所述的金线莲初代培养基中以MS为基础培养基，其余各组分含量分别为:6-BA 5mg/L、ZT 1.5mg/L、2，4-D 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.5g/L，培养基pH为5.5;
4)第一阶段，即第1-12个月，将无菌操作后的茎尖或茎段在温度为8°C进行低温诱导分化；
5)第二阶段，即第13-60个月，将分化后的种苗进行低温、暗处理，温度控制在2°C，得种苗；