一种茖葱快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业技术领域，具体涉及一种茗葱快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 植物组织培养技术是以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术，是指在无菌 条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体在人工配制的培养基上，给予适宜的条件 进行培养，诱导产生愈伤组织或不定芽等，或者长成完整植株的过程。该技术自20世纪初 建立以来，在理论研究和应用技术上不断发展，已广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良、 基因工程育种、种质资源保存、次生代谢产物生产等方面，产生了巨大的经济效益和社会效 益，对现代农业和医药等领域产生了深刻影响。
[0003] 茗葱，又名寒葱，为百合科葱属的植物，多年生草本。近年来，国内外许多学者从茗 葱中分离出许多化学成分，主要为含硫化合物、黄酮类化合物、莆体化合物及糖类，并对这 些化学成分的药理方面展开了研究。经试验验证了其中一些化学成分对预防血栓、动脉硬 化、脑梗塞有良好的作用效果。并且，由于茗葱葱香味浓，略带爽口野味，口感极佳。加之其 内含物有显著的药理作用，既能作美味见于餐桌，又是没有副作用的天然保健食品。在日本 和韩国的市场上，茗葱是极受欢迎的蔬菜之一。但是，目前我国关于茗葱的引种驯化还鲜有 报道。野生茗葱生长于海拔1，000米至2, 500米的地区，常生长在草地、林下、阴湿山坡或 沟边。由于对野生茗葱的掠夺式采摘，造成这一野生资源正面临着枯竭，加之野生茗葱生长 受气候等条件的限制，远远不能满足和市场需要。
[0004] 茗葱的繁殖较难，同大多数葱属植物相同，其繁殖方式也可分为有性繁殖与无性 繁殖。研究表明，用鳞茎种植要比用种子繁殖好，因为用种子繁殖需要3-5年才能采摘食 用，并且种子的生命活力降低很快，发芽困难、发芽率较低，而用鳞茎繁殖可以提高鳞茎产 量；目前国外学者提出了用组织培养的方法进行繁殖，并且研究得较为深入，但因其费用较 高，还不能在生产上大量应用。因此，如何短时间内快速大量繁殖茗葱成为茗葱产业化生产 的关键。
[0005] 利用组织培养技术对茗葱进行组培快繁，能够实现茗葱在短时间内的快速增殖， 但是增殖率的高低是决定茗葱能否通过组培快繁途径进行工厂化生产的瓶颈，因此发明一 种茗葱快速繁殖的方法是从根本解决上述问题的有效途径。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决茗葱生长周期长，且组培快繁增殖效率不高，难以满足 大规模生产的问题，而提供一种茗葱快速繁殖方法。
[0007] 一种茗葱快速繁殖方法，它包括： 1)茗葱鳞茎盘的获得 取茗葱鳞茎，去除茗葱须根，剥除外层鳞片，保留以中心生长点为中心，直径为0. 4-lcm 的鳞茎盘及其上部包裹的鳞片，获得茗葱的中心部位； 将茗葱中心部位冲洗，消毒，用滤纸吸干水分； 经过外植体灭菌后，在中心部位距底端3 - 5mm处横切并去除上部鳞片，沿主生长点垂 直切线方向，纵向分割成4份，去除主生长点及主生长点所在的鳞茎盘，分别培养； 2) 茗葱鳞茎盘增殖 以 MS 为基础培养基，添加 6-BA 0. 5-2. O mg/L、NAA 0. 05-0. 5 mg/L，PH 调节至 5. 8,诱 导丛生芽； 3) 继续培养成种植苗； 所述的切割成4份，是以主生长点两条垂直的切线为切口，进行切割，切成4份，其中 只有一个1/4份切块带有主生长点所在的鳞茎盘，剥掉其主生长点和主生长点所在的鳞茎 盘； 所述的1/4份鳞茎盘上部的鳞片基部再进行切割，至远主生长点端高，近主生长点端 低的斜面。
[0008] 所述的6-BA和NAA的添加量分别为I. 0 mg/L和0· I mg/L ; 步骤3)所述的继续培养成苗，是以MS为基础培养基，添加 NAA 0. 1-1 mg/L，PH调节 至5. 8 ;将丛生苗接种于生根培养基中，3周后丛生苗生根；将生根后的丛生苗分割成单株， 接种于壮苗培养基中，获得茗葱种苗；种苗经驯化后，种植； 所述的茗葱中心部位消毒，用75%酒精浸泡消毒Imin后，随后用1% NaClO溶液浸泡 消毒 15- 20min。
[0009] 本发明提供了一种茗葱快速繁殖方法，将茗葱中心部位清洗、消毒。经过外植体灭 菌后，在中心部位距底端3 - 5mm处横切并去除上部鳞片，沿主生长点垂直切线方向，纵向 分割成4份，去除主生长点及主生长点所在的鳞茎盘，诱导丛生芽，并培养成苗，通过上述 培养过程的优化建立了茗葱鳞茎盘快速繁殖体系，获得了大量的茗葱试管苗，该体系增殖 时间短，增殖系数大，遗传稳定性高，通过该体系能够实现茗葱的快速繁育，实现茗葱产业 的种植。
【附图说明】
[0010] 图1不同激素组合对分蘖洋葱茎尖增殖的影响（a :分蘖洋葱茎尖；b :茎尖在 6-BA、NAA组合中的增殖情况；c :茎尖在6-BA、IAA中的增殖情况）； 图2分蘖洋葱鳞茎盘的获得； 图3分蘖洋葱试管微鳞茎盘切割步骤流程； 图4分蘖洋葱试管微鳞茎盘切割步骤流程示意图； 图5.分蘖洋葱试管鳞茎盘增殖（a :分蘖洋葱试管微鳞茎盘；b :第2周显微镜下观察到 的增殖情况；c :第3周丛生芽增殖、生长情况；d :第4周丛生芽增殖、生长情况）； 图6.分蘖洋葱试管苗壮苗培养（a :分蘖洋葱试管增殖丛生苗；b :单株分蘖洋葱试管 苗；c :壮苗培养后的试管苗）； 图7茗葱中心部位的获得； 图8茗葱鳞茎盘的获得； 图9茗葱鳞茎盘增殖苗的获得； 图10茗葱增殖苗生根； 图11大蒜鱗莖盘的获得； 图12大蒜鳞茎盘接种； 图13大蒜鳞茎盘增殖。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1分蘖洋葱茎尖增殖 将分蘖洋葱茎尖分别接种于不同浓度的6-BA、NAA组合，6-BA、IAA组合培养基中（表 1 )，两种激素组合均能够获得分蘖洋葱试管增殖苗，但相同浓度的IAA和NAA在进行增殖诱 导时，差异很大。其中在6-BA、NAA激素组合中诱导的增殖苗长势较好，且分化系数较高，在 培养4周时，平均增殖系数可达3. 87 ;6-BA、IAA激素组合虽然也能够实现茎尖增殖，但所获 得的增殖苗细、弱，分化系数低，且有白化苗出现(如图1)。可见，IAA的作用效果不如NAA。 因此确定MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. lmg/L培养基为茎尖增殖最佳培养基。
注：MS为基础培养基。
[0013] 实施例2分蘖洋葱鳞茎盘增殖 取分蘖洋葱一枚，去除分蘖洋葱鳞茎盘木栓化的部位，保留以中心生长点为中心，直径 为0. 4-lcm的鳞茎盘及其上部包裹的鳞茎，得到分蘖洋葱中心部位。将分蘖洋葱中心部位 用流水冲洗0. 5 h，用75%酒精浸泡消毒I min后，随后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20 min，无菌水冲洗3-5次以清除残余的NaCIO,用滤纸吸干水分备用（如图2)。
[0014] 然后去除上部鳞茎，保留包含主生长点在内的鳞茎盘，将鳞茎盘切割成4份后去 除主生长点及主生长点鳞茎盘，分别接种于以MS为基础培养基，添加 6-BA (0. 2-0. 8 mg/ L)、NAA (0. 1-2. Omg/L)，PH调节至5. 8的增值培养基中培养，诱导丛生芽。在25°C、光照 时间为16h、光照强度为25001ux条件下，经过4周的诱导，以6-BA、NAA组合诱导效果最好； 6-BA、IAA组合也能诱导出丛生芽，但增殖系数低，再生苗存在畸形苗。其中鳞茎盘在添加 6-BAO. 6mg/L、NAAO. lmg/L的培养基中，4周后，分化数达到最大值，每个鳞莖盘最大增殖系 数(增殖系数=分化芽总数/接种数)可达20 (见表2)。随着诱导时间的增加，鳞茎盘分化 数增加，但在诱导第4周后鳞茎盘分化数不再增加，鳞茎盘的分化率达最大值(见表3)。
注：MS为基础培养基。
[0017] 实施例3分蘖洋葱脱毒苗试管结球 取分蘖洋葱茎尖部位，流水冲洗半小时，用75%酒精浸泡消毒Imin后，随后用1% NaClO溶液浸泡消毒15-20min，无菌水冲洗3-5次以清除残余的NaCIO,用滤纸吸干水分 备用，显微镜下剥离分蘖洋葱茎尖生长点〈0. 3mm部分，在以MS为基础培养基，添加 6-BA、 IAA的启动培养基中诱导成苗。
[0018] 茎尖成苗后，分别以蔗糖为基础碳源设置30mg/L、45mg/L、60mg/L、75mg/L、90mg/ L共5个碳源糖浓度，探讨不同糖浓度对分蘖洋葱试管苗结球的影响，筛选最佳结球培养基 中糖浓度，通过培养发现，随着糖浓度的增加鳞茎结球直径、鲜重增加。当糖浓度高于75 mg/L时，结球速度加快但影响根的生长，导致最终鳞茎平均直径、鲜重降低(见表4)。
[0019] 在脱毒苗结球培养过程中，通过对培养昼夜温差的调控，调节试管苗的结球速度， 针对分蘖洋葱生长的适宜温度分别设置25°C /25°C、25°C /20°C、25°C /15°C共3组昼夜温 度处理，筛选最佳培养温度。在昼夜温差为KTC时鳞茎直径和鳞茎鲜重要优于其他处理。 由此确定在分蘖洋葱脱毒苗结球过程中，最佳培养温度为白天25°C，夜间15°C (见表5)。
[0020] 在脱毒苗结球培养过程中，通过对培养过程中的光照强度、光周期的调控，调节 试管苗的结球速度，针对分蘖洋葱生长条件分别设置3组光照强度、光周期处理。结果表 明，随光照强度和光照时间的延长，试管球的平均直径和鳞茎鲜重逐步增加，在光照强度为 25001u X，16h光照、8h黑暗条件时有利于分蘖洋葱脱毒试管苗结球，其试管球鳞茎平均直 径、鳞茎