八角莲的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特指一种八角莲的快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 鬼臼毒素（Podophyllotoxin，ΡΤ0Χ)是木脂素类化合物中的环木脂内酯，是 从鬼白类植物中提取分离到的一种具有抗肿瘤活性的天然产物，是人工合成依托泊苷 (etoposide，VP-16)和替尼泊苷（teniposide，VM-26)等药物的前体。研究表明，鬼臼毒素 对于治疗食道癌、子宫癌等顽症具有特效，市场需求十分巨大。随着鬼白毒素新功能的不 断开发和近年来人类患癌率的逐年增加，其市场需求量也将迅速加大。鬼白毒素主要从小 檗科Berberidaceae多年生草本植物如八角莲属、桃儿七属和山荷叶属及足叶草属等中提 取，但产量有限。其中，八角莲Dysosma Versipellis(Hance)M. Cheng是生产鬼臼毒素的主 要传统药源植物。
[0003] 八角莲是我国传统常用中药之一，具清热解毒，化痰散结、祛痰消肿之功用。长期 以来由于过度采挖及其自然繁殖率低，造成野生资源亏缺，物种濒危，目前已被列为国家珍 稀濒危三级保护植物。在人工栽培中，由于八角莲座果率低，种子量少，种子萌发的幼苗经 过5-6年才能收获，因而限制了八角莲的生产。
[0004] 对八角莲的研究，过去主要集中于八角莲的分类鉴定、有效成分分析、药理学和栽 培学等方面。近年来，黄家云等（2007)诱导八角莲愈伤组织产生丛生芽，并生根形成幼 苗。黄家云等（2008)液体振荡培养八角莲愈伤组织，并进行了鬼白毒素的检测。唐凤鸾等 (2008)诱导八角莲种子幼苗形成丛生芽，进而诱导愈伤及根，直接形成再生植株。韦莹等 (2011)报道了八角莲愈伤组织的诱导和分化，并成功再生出植株。尽管八角莲的组织培养 取得了一定的进展，但诱导的愈伤组织易褐化、分化率低，且易变异，严重影响了通过组培 快速繁殖八角莲种苗的生产实践。
[0005] 体细胞胚胎发生是植物愈伤组织在固体培养基上经过多次继代后，产生分生细胞 化，形成胚性愈伤组织；这种组织内的细胞团进一步发展成为胚状体。利用植物能高频率 产生胚状体的实验系统，结合在摇床上进行液体培养，同步筛选以获得性状一致的高质量 胚状体。通过植物胚性再生植株，具有生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点，而 且可以筛选优良无性系，结合活性成分的筛选，获得活性成分含量高且遗传稳定的植株，这 已成为开展植物次生代谢与调控机制的良好受体材料。一些药用植物如黄连（桂耀林等， 1989)、檀香（Shekhawat et al. 2008)、紫背天葵（郭仰东等，2010)等已成功建立胚性细胞 悬浮培养体系。但是，目前除了本实验室的研究成果外，尚无有关八角莲植物体细胞胚胎发 生的报道。
[0006] 发明的内容
[0007] 本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优 点。
[0008] 本发明还有一个目的是为了克服八角莲胚性细胞悬浮培养系的技术空白，提供一 种八角莲的快速繁殖的方法，在本发明中，获得的八角莲胚性细胞可以诱导八角莲植株的 再生，具有生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点。
[0009] 为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种八角莲的快速繁殖方法，包 括以下步骤：
[0010] 步骤一：制作八角莲的无菌外植体；
[0011] 步骤二：利用诱导培养基培养所述无菌外植体，得到胚性愈伤组织，所述诱导培养 基包括MS、0. 5~2. Omg/L的2,4-D生长素 、L 0~I. 5mg/L的木醋液、0· 2~0· 5mg/L的植 物精油和6g/L的琼脂；
[0012] 步骤三：利用第一增殖培养基培养所述胚性愈伤组织，继代培养2~3代，得到继 代愈伤组织，所述第一增殖培养基包括MS、0. 5~2. Omg/L的2,4-D生长素、20~25mg/L的 水苏糖和6g/L的琼脂；
[0013] 步骤四：利用分化培养基培养所述继代愈伤组织，得到体胚，所述分化培养基包括 MS，0~1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0· 5~2. Omg/L的萘乙酸和6g/L的琼脂；
[0014] 步骤五：利用第二增殖培养基培养所述体胚，得到继代体胚，所述第二增殖培养基 包括MS、0~1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0. 5~2. Omg/L的萘乙酸和0~2. Omg/L 的2,4-D生长素；
[0015] 步骤六：利用植株再生培养基培养所述继代体胚，得到八角莲植株，所述植株再生 培养基包括MS、1. 0~I. 5mg/L的中药粉、1. 0~I. 4mg/L的赤霉素3,0. 2~0. 6mg/L的吲 哚丁酸、〇. 3~0. 7mg/L的海泡石粉和6g/L的琼脂；
[0016] 所述中药粉的制作方法为：将重量份数为30~40份的八角莲、18~25份的风流 果、23~28份的灵香草、15~17份的融安金桔和10~15份的白僵蚕混合后煎煮30~ 40min，过滤得中药渣，经高压灭菌后烘干，然后粉碎过200目筛网，即得所述中药粉。
[0017] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，还包括：
[0018] 步骤七、将所述八角莲植株移至壮苗培养基中培养15~20天，得到八角莲幼苗， 所述壮苗培养基包括促根培养基和促茎培养基，所述壮苗培养基放置于培养箱中，所述促 茎培养基位于所述促根培养基的上方，从八角莲植株的下方开始，将八角莲植株的1/5浸 没于所述促根培养基，将八角莲植株的1/3置于所述促茎培养基中；
[0019] 所述促茎培养基包括MS、1. 0~I. 5mg/L的所述中药粉、1. 0~I. 4mg/L的赤霉素 3,0· 2~0· 6mg/L的Π 引噪丁酸、0· 3~0· 7mg/L的海泡石粉和6g/L的琼脂；
[0020] 所述促根培养基包括MS、10~15mg/L的柚子皮提取液、0. 8~I. 2mg/L的吲哚丁 酸和1. 0~I. 5mg/L的木醋液；所述柚子皮的提取液的制作方法为：将柚子皮切碎，暴晒 1~2天，然后放入沸水中煮沸30~40min，趁热过滤，并向热的滤液中加入柚子皮质量0. 1 倍的硼酸，将所述滤液真空减压浓缩至6mg/L，设置真空度为0. 05~0. 06MPa，减压浓缩时 控制温度为55°C，即得所述柚子皮提取液；
[0021] 步骤八、将所述八角莲幼苗移栽至基质中培养。
[0022] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，所述培养箱包括上箱体和下箱体，所述 上箱体与所述下箱体可拆卸连接，所述上箱体为上下贯通的筒体，所述上箱体的下平面设 置有与其下平面尺寸一致的厚度为〇. 01~〇. 03毫米的聚乳酸薄膜，所述聚乳酸薄膜上开 有多个通孔，一株所述八角莲植株穿过一个所述通孔；
[0023] 所述下箱体为下部封闭上部敞开的筒体，所述下箱体外部套设有可拆卸的保温 套，所述促茎培养基放置在所述聚乳酸薄膜上，所述促根培养基放置在所述下箱体内。
[0024] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，所述无菌外植体、所述胚性愈伤组织、 所述继代愈伤组织和所述体胚在各自培养基中的培养条件均为：温度20°C~24°C，pH值 5. 6~6. 0,暗培养15~20天，所述继代体胚在植株再生培养基中的培养条件为24~26°C， 1000~2000Lux光照条件下培养至植株形成，其中光照时间为每天10h。
[0025] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，所述步骤八中，所述八角莲幼苗移栽至 基质中培养时，将所述八角莲幼苗连带所述促茎培养基和所述聚乳酸薄膜一起移栽至基质 中，使得所述聚乳酸薄膜的下表面紧贴所述基质上表面，所述聚乳酸薄膜的上表面承载所 述促茎培养基，所述八角莲幼苗在基质中培养8~10天后，将所述促茎培养基捣碎，调整所 述八角莲幼苗在基质中的间距，使得每相邻的两个所述八角莲幼苗间距为30~35cm，继续 培养至八角莲成熟；
[0026] 所述基质从下到上由草原灰，壤土，珍珠岩，木肩，松针叶按重量比为 1 : 8 : 2 : 4 : 3 构成。
[0027] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，在所述无菌外植体接入所述诱导培养 基之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为：
[0028] 选取八角莲的叶片或根或茎作为外植体，将所述外植体置于烧杯中，用两性表面 活性剂浸泡，并置于超声波中震荡10~20min，用去离子水冲洗40~50min，在冲洗过程中 用软毛刷轻轻洗刷所述外植体表面的污垢，然后用无菌滤纸吸干所述外植体外部的水分后 切成5mm 2的小块，得到所述无菌外植体；
[0029] 所述两性表面活性剂为：20~25重量份的N-长链烷氧基羧酸型甜菜碱，15~18 重量份的α -十六烷基三甲基甜菜碱，10~13重量份的N-烷基-β -亚氨基二丙酸，5~ 10重量份的十二烷基二甲基甜菜碱和60~70重量份的无菌水的混合溶液。
[0030] 优选的是，所述的八角莲的快速繁殖方法，所述体胚在所述第二增殖培养基中培 养过程中，所述第二增殖培养基位于转速为120r/min的摇床中，且所述第二增殖培养基每 隔3~5天更换一次培养基。
[0031] 本发明至少包括以下有益效果：
[0032] 第一、在本发明中，获得的八角莲胚性细胞可以诱导八角莲植株的再生，具有生长 速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点，而且可以筛选优良无性系，结合活性成分鬼臼 毒素的筛选，获得活性成分鬼白毒素含量高且遗传稳定的植株，这为开展植物次生代谢与 调控机制的良好受体材料，同时也为鬼白毒素的生产提供了一种优质且可持续利用的原料 来源；
[0033] 第二、八角莲的外植体消毒首先采用两性表面活性剂浸泡，甜菜碱性的两性表面 活性剂具有很好的抗菌性，可以抑制部分细菌和真菌的生长繁殖，同时两性表面活性剂中 的烷基二甲基的甜菜碱对二价铜具有很好的螯合能力，将二价铜从多酚氧化酶中螯合出 来，使得多酚氧化酶失去氧化能力，减少八角莲外植体的褐变；
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