部对基质有保温保暖的作用，聚乳酸薄膜3最 终降解为八角莲所需的营养物质，提高了促茎培养基和聚乳酸薄膜3的经济使用价值；
[0089] 所述基质从下到上由草原灰，壤土，珍珠岩，木肩，松针叶按重量比为 1 : 8 : 2 : 4 : 3 构成。
[0090] 如图1所示，其中，所述培养箱包括上箱体1和下箱体2,所述上箱体1与所述下箱 体2可拆卸连接，所述上箱体1为上下贯通的筒体，所述上箱体1的下平面设置有与其下平 面尺寸一致的厚度为0. 02毫米的聚乳酸薄膜3,所述聚乳酸薄膜3上开有多个通孔4, 一株 所述八角莲植株穿过一个所述通孔4 ;
[0091] 所述下箱体2为下部封闭上部敞开的筒体，所述下箱体2外部套设有可拆卸的保 温套5,所述促茎培养基放置在所述聚乳酸薄膜3上，所述促根培养基放置在所述下箱体2 内；
[0092] 上下可拆卸的培养箱设计结构简单，操作简便，为八角莲幼苗同时提供两种不同 培养基，在温度较低时可以将保温套5套装在下箱体2外部，保证八角莲幼苗生长所需的环 境。
[0093] 实验对比
[0094] 〈对比例1>
[0095] 对八角莲的叶片或根或茎的外植体采用以下三种方法消毒后，利用本发明的栽培 方法栽培，栽培调节相同，每种消毒方法分别处理40个八角莲的外植体，其存活率见表1， 其中洗洁精消毒采用的是质量分数为〇. 1 %的洗洁精水溶液浸泡8min，浸泡过程中用毛笔 轻轻洗刷所述外植体表面污垢，取出所述外植体后用流水冲洗ISmin ;乙醇消毒采用的是 先用质量分数为70%的乙醇溶液浸泡10s，用质量分数为1. 0%的次氯酸钠消毒20min，之 后用无菌水冲洗30min ;两性表面活性剂消毒采用的是23重量份的N-长链烷氧基羧酸型 甜菜碱，16重量份的α -十六烷基三甲基甜菜碱，12重量份的N-烷基-β -亚氨基二丙酸， 8重量份的十二烷基二甲基甜菜碱和65重量份的无菌水的混合溶液浸泡，并置于超声波中 震荡15min，用去离子水冲洗45min，在冲洗过程中用软毛刷轻轻洗刷所述外植体表面的污 垢。
[0096] 表1采用三种消毒方法对八角莲外植体消毒对其褐变率的影响
[0097]
[0098] 〈对比例2>
[0099] 对八角莲植株采用以下的两种方法进行移栽，方法一，将八角莲植株直接移栽至 基质中，方法二，将八角莲植株按实施例3中移栽方法，先在培养箱中培养18天后得到八角 莲幼苗，再将八角莲幼苗移栽至基质中，两种方法中的基质与实施例3中的基质相同。每种 方法移栽培养50株八角莲植株。
[0100] 表2方法一和方法二对八角莲植株的移栽成活率的影响
[0101]
[0102] 〈对比例3/
[0103] 八角莲快速繁殖方法A，继代体胚的植株再生培养基中不加中药粉；方法B，继代 体胚的植株再生培养基同实施例3中的植株再生培养基，两种方法其他培养步骤均和实施 例3中的其他培养步骤，每种方法中用50个八角莲外植体。
[0104] 表3方法A和办法B快速繁殖八角莲对八角莲成活率的影响
[0105]
[0106] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1. 一种八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一：制作八角莲的无菌外植体； 步骤二：利用诱导培养基培养所述无菌外植体，得到胚性愈伤组织，所述诱导培养基包 括MS、0. 5~2. Omg/L的2,4-D生长素、1.0 ~I. 5mg/L的木醋液、0? 2~0? 5mg/L的植物精 油和6g/L的琼脂； 步骤三：利用第一增殖培养基培养所述胚性愈伤组织，继代培养2~3代，得到继代愈 伤组织，所述第一增殖培养基包括MS、0. 5~2. Omg/L的2,4-D生长素、20~25mg/L的水苏 糖和6g/L的琼脂； 步骤四：利用分化培养基培养所述继代愈伤组织，得到体胚，所述分化培养基包括MS， 0~1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0. 5~2. Omg/L的萘乙酸和6g/L的琼脂； 步骤五：利用第二增殖培养基培养所述体胚，得到继代体胚，所述第二增殖培养基包括 MS、0~1.0 mg/L的6-苄氨基腺嘌呤分裂素、0. 5~2. Omg/L的萘乙酸和0~2. Omg/L的2， 4-D生长素； 步骤六：利用植株再生培养基培养所述继代体胚，得到八角莲植株，所述植株再生培养 基包括MS、L 0~I. 5mg/L的中药粉、L 0~I. 4mg/L的赤霉素3,0? 2~0? 6mg/L的吲噪丁 酸、0? 3~0? 7mg/L的海泡石粉和6g/L的琼脂； 所述中药粉的制作方法为：将重量份数为30~40份的八角莲、18~25份的风流果、 23~28份的灵香草、15~17份的融安金桔和10~15份的白僵蚕混合后煎煮30~40min， 过滤得中药渣，经高压灭菌后烘干，然后粉碎过200目筛网，即得所述中药粉。2. 如权利要求1所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，还包括： 步骤七、将所述八角莲植株移至壮苗培养基中培养15~20天，得到八角莲幼苗，所述 壮苗培养基包括促根培养基和促茎培养基，所述壮苗培养基放置于培养箱中，所述促茎培 养基位于所述促根培养基的上方，从八角莲植株的下方开始，将八角莲植株的1/5浸没于 所述促根培养基，将八角莲植株的1/3置于所述促茎培养基中； 所述促茎培养基包括MS、1. 0~I. 5mg/L的所述中药粉、1. 0~I. 4mg/L的赤霉素3， 0? 2~0? 6mg/L的吲噪丁酸、0? 3~0? 7mg/L的海泡石粉和6g/L的琼脂； 所述促根培养基包括MSUO~15mg/L的柚子皮提取液、0. 8~I. 2mg/L的吲哚丁酸和 1. 0~I. 5mg/L的木醋液；所述柚子皮的提取液的制作方法为：将柚子皮切碎，暴晒1~2 天，然后放入沸水中煮沸30~40min，趁热过滤，并向热的滤液中加入柚子皮质量0. 1倍的 硼酸，将所述滤液真空减压浓缩至6mg/L，设置真空度为0. 05~0. 06MPa，减压浓缩时控制 温度为55°C，即得所述柚子皮提取液； 步骤八、将所述八角莲幼苗移栽至基质中培养。3. 如权利要求2所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，所述培养箱包括上箱体 和下箱体，所述上箱体与所述下箱体可拆卸连接，所述上箱体为上下贯通的筒体，所述上箱 体的下平面设置有与其下平面尺寸一致的厚度为0. 01~0. 03毫米的聚乳酸薄膜，所述聚 乳酸薄膜上开有多个通孔，一株所述八角莲植株穿过一个所述通孔； 所述下箱体为下部封闭上部敞开的筒体，所述下箱体外部套设有可拆卸的保温套，所 述促茎培养基放置在所述聚乳酸薄膜上，所述促根培养基放置在所述下箱体内。4. 如权利要求3所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，所述无菌外植体、所述胚 性愈伤组织、所述继代愈伤组织和所述体胚在各自培养基中的培养条件均为：温度20°C~ 24°C，pH值5. 6~6. 0,暗培养15~20天，所述继代体胚在植株再生培养基中的培养条件 为24~26°C，1000~2000Lux光照条件下培养至植株形成，其中光照时间为每天10h。5. 如权利要求4所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤八中，所述八角 莲幼苗移栽至基质中培养时，将所述八角莲幼苗连带所述促茎培养基和所述聚乳酸薄膜一 起移栽至基质中，使得所述聚乳酸薄膜的下表面紧贴所述基质上表面，所述聚乳酸薄膜的 上表面承载所述促茎培养基，所述八角莲幼苗在基质中培养8~10天后，将所述促茎培养 基捣碎，调整所述八角莲幼苗在基质中的间距，使得每相邻的两个所述八角莲幼苗间距为 30~35cm，继续培养至八角莲成熟； 所述基质从下到上由草原灰，壤土，珍珠岩，木肩，松针叶按重量比为1 : 8 : 2 : 4 : 3 构成。6. 如权利要求5所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，在所述无菌外植体接入 所述诱导培养基之前还包括获得无菌外植体的步骤，所述获得无菌外植体的步骤为： 选取八角莲的叶片或根或茎作为外植体，将所述外植体置于烧杯中，用两性表面活性 剂浸泡，并置于超声波中震荡10~20min，用去离子水冲洗40~50min，在冲洗过程中用软 毛刷轻轻洗刷所述外植体表面的污垢，然后用无菌滤纸吸干所述外植体外部的水分后切成 5mm 2的小块，得到所述无菌外植体； 所述两性表面活性剂为：20~25重量份的N-长链烷氧基羧酸型甜菜碱，15~18重量 份的a -十六烷基三甲基甜菜碱，10~13重量份的N-烷基-P -亚氨基二丙酸，5~10重 量份的十二烷基二甲基甜菜碱和60~70重量份的无菌水的混合溶液。7. 如权利要求6所述的八角莲的快速繁殖方法，其特征在于，所述体胚在所述第二增 殖培养基中培养过程中，所述第二增殖培养基位于转速为120r/min的摇床中，且所述第二 增殖培养基每隔3~5天更换一次培养基。
【专利摘要】本发明公开了一种八角莲快速繁殖方法，包括以下步骤：步骤一：制作八角莲的无菌外植体；步骤二：利用诱导培养基培养所述无菌外植体，得到胚性愈伤组织；步骤三：利用第一增殖培养基培养所述胚性愈伤组织，继代培养2～3代，得到继代愈伤组织；步骤四：利用分化培养基培养所述继代愈伤组织，得到体胚；步骤五：利用第二增殖培养基培养所述体胚，得到继代体胚；步骤六：利用植株再生培养基培养所述继代体胚，得到八角莲植株。在本发明中，获得的八角莲胚性细胞可以诱导八角莲植株的再生，具有生长速度快、植株再生频率高、性状稳定等优点。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105010146
【申请号】CN201510500146
【发明人】谭小明, 周雅琴, 余丽莹, 韦莹, 周小雷
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年8月14日