越南奇楠沉香组织培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养的方法，具体涉及涉及一种越南奇楠沉香 crassfla Pierre.组织培养的方法。
【背景技术】
[0002] 越南奇楠沉香（J识/iiaria crawfla Pierre.)是瑞香科沉香属植物，天然分布于 越南、柬埔寨、老挝、泰国等海拔300~900m、年降雨量1200mm左右的丘陵、山地，是东南 亚国家生产高品质沉香木和沉香油的主要树种。由于过度砍伐，该树种在许多天然林中已 涉Ii临灭绝，《颜临绝种野生动植物国际贸易公约》（CITES，Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)将越楠奇楠沉香列为及危品 种。在广东部分区域有香农从越南引种越南奇楠沉香进行栽培，但种苗价格极高，一株奇楠 沉香树苗价格高达10~20元不等。
[0003] 越南奇楠沉香需生长6~8年开始开花，而优良的种子必须采自树龄15年以上的 母树。奇楠沉香的种子寿命又极短，如果不经过特别处理，只能储存1周左右。即使在最佳 保存条件下(湿度为25%，温度为8°C )保存一个月，发芽率也从41%降至22%。因此，越南奇 楠沉香人工种植所需要的种苗极其匮乏。
[0004] 种子繁殖只能繁殖常规苗木，不能繁殖无性系苗木。林木基因组杂合程度高，实生 苗造林分化大。越南奇楠沉香也不例外，采用实生苗造林，会存在分化大，结香率及结香品 质参差不齐的问题，影响了种植收益。越南奇楠沉香在自然条件下自然结香的比例是极低 的，必须要经过人工诱导结香，才能保证有较高的结香率，但如果采用种子苗进行人工诱导 结香，由于个体间遗传差异大，同样的方法所诱导的结香效果不一样，导致沉香的产量极不 稳定，严重影响了香农种植的积极性。
[0005] 要想人工栽培的越南奇楠沉香有高品质和稳定的结香率，必须通过组培快繁技术 走越南奇楠沉香无性系化的道路。用无性系苗进行人工诱导结香，才能获得最好最稳定的 人工诱导结香技术，才能获得得香率高而均一、品质优良的沉香，才能产生高效的经营效 率。
[0006] 越南奇楠沉香是从越南引进的珍贵树种，种质资源极其匮乏，少量已有的人工栽 培奇楠沉香树由于来自种子苗，得香率也不稳定，如果奇楠沉香的种植不解决组培快繁的 技术问题，不走无性系化的道路，将难以做到经营的集约化，生产的高效性，也无法满足市 场对越南奇楠沉香种苗的大量需求。也将严重制约奇楠沉香无性系育种、良种的中试和良 种的推广。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种越南奇楠沉香crasMa Pierre.组织培养 的方法。
[0008] 本发明所采取的技术方案是： 一种越南奇楠沉香crasma Pierre.组织培养的方法，包括以下步骤： 1) 外植体的消毒：将越南奇楠沉香种子进行消毒处理； 2) 丛芽诱导培养：将上步消毒后的种胚接种至丛芽诱导培养基中，每培养28~32天 后将种胚转接至新的丛芽诱导培养基中，转接3~4次，奇楠沉香种胚即可被诱导出多个丛 芽； 3) 增殖培养：将上步诱导出丛芽的越南奇楠沉香组培苗接种到继代增殖培养基中，每 培养28~32天将奇楠沉香增殖苗转接至新的继代增殖培养基中继续培养； 4) 生根培养：将增殖培养中高度达2cm以上的单芽切下接种至生根培养基中，培养 15~20天，当至少70%的增殖苗开始生根后进入炼苗阶段； 5) 炼苗：将上步获得的奇楠沉香生根芽苗在光强3000~6000 Lx、温度26~30°C条 件下炼苗10~20天； 6) 移植及苗期管理：将炼苗后的苗木移植到土壤中，进行田间栽培管理。
[0009] 进一步的，步骤1)中所述种子消毒处理具体方法为：将越南奇楠沉香种子用无菌 水清洗干净后，用〇. 8~I. 2g/L升汞消毒28~32min，再用无菌水清洗干净。
[0010] 进一步的，步骤2)中所述丛芽诱导培养基为含有0. 58~0. 62mg/L6-BA和0. 08~ 0· 12 mg/L IBA 的 MS 培养基。
[0011] 进一步的，步骤2)、步骤3)和步骤4)的培养条件均为：温度24~26°C、光照8~ IOh · d \ 光照强度 2500 ~3500Lx。
[0012] 进一步的，步骤3)中所述增殖培养基为含有0· 18~0· 22mg/L 6-BA和0· 08~ 0· 12 mg/LIBA 的 MS 培养基。
[0013] 进一步的，步骤4)中所述生根培养基为含有0. 08~0. 12mg/L NAA的MS培养 基，并且其中大量元素的含量为正常MS的0. 24~0. 26倍，微量元素的含量为正常MS的 0· 45 ~0· 55 倍。
[0014] 进一步的，步骤6)中所述的土壤含有68~72%黄泥和28~32%泥炭土基质。
[0015] 进一步的，步骤6)中所述田间栽培管理的具体方法为：移植后先在遮阳率为90~ 95%，相对湿度为85%~90%，温度为25~33°C的条件下培养12~14天；然后将苗木置于 遮阳率为75%~80%，湿度为75%~80%，温度为25~33°C的条件下培养13~15天；最后 将苗木置于遮阳率为40~60%的条件下进行培养，当苗木高度多25cm后，将其完全在自然 环境条件下进行培养。
[0016] 进一步的，步骤6)中移植的时间为3~6月或9~11月。
[0017] 本发明的有益效果是： 本发明建立了一种能够获得大量越南奇楠沉香无性系苗木的组织培养方法，其中，本 发明通过研究发现越南奇楠沉香丛芽诱导培养基含有0. 58~0. 62mg/L6-BA和0. 08~ 0· 12 mg/L IBA、增殖培养基含有 0· 18 ~0· 22mg/L 6-BA 和 0· 08 ~0· 12 mg/LIBA，生根培 养基含有〇. 08~0. 12mg/L NAA，且生根培养基的大量元素的含量为正常MS的0. 24~0. 26 倍，微量元素的含量为正常MS的0. 45~0. 55倍，才能确保越南奇楠沉香无性系苗木的高 产率，生长快，且苗木健壮。
[0018] 本发明方法获得越南奇楠沉香无性系苗木的产率高，时间快，且所获得的苗木健 壮，这些苗木一是可以解决种植行业越南奇楠沉香苗木缺乏的问题；二是用越楠奇楠沉香 的无性系苗进行人工诱导结香，能探索出最好最稳定的人工诱导结香技术，容易得到得香 率高而均一、品质优良的沉香，能产生高效的经营效率；三是将推进越南奇楠沉香无性系育 种、良种的中试和良种的推广。
【附图说明】
[0019] 图1为大量元素的含量（以MS为单位）对越南奇楠沉香如?/iJaria crasma Pierre.生根率的影响； 图2为微量元素的含量（以MS为单位）对越南奇楠沉香J识/iJaria Pierre. 生根率的影响； 图3为NAA的浓度（mg/L)对越南奇楠沉香crassfla Pierre.生根率的影 响。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0021] 实施例1 本实施从越南引进少量的越南奇楠沉香crasma Pierre.优树种子，经过 组织培养繁殖，获得了 20个无性系，并繁殖组培瓶苗苗木5万株供热带林业研究所森林培 育与技术研究首席专家组营造无性系示范林。具体操作步骤如下： 1)外植体的消毒 将越南奇楠沉香种子用无菌水清洗2次，然后用lg/L升汞消毒30分钟，再用无菌水清 洗干净，其洗4次，前3次每次5分钟，最后一次10分钟，即可。
[0022] 2)丛芽诱导培养 将600粒消过毒的种胚接种至丛芽诱导培养基中，丛芽诱导培养基为含有0. 6mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA的MS培养基，放入培养室培养，培养条件为温度25± 1°C、光照8~ IOh · d \光照强度2500~35001x，培养30天后，获430个无污染的种胚，消毒成功率为 71. 7% ;将无菌种胚再转接到新丛芽诱导培养基上，30天后获得170个萌发种胚；将萌发种 胚接种到新丛芽诱导培养基中，培养30天后再转接至新丛芽诱导培养基中，再培养30天后 获得113颗诱导出正常丛芽的奇楠沉香苗，丛芽诱导率为66. 5%。
[0023] 即在丛芽诱导培养过程中，将消毒后的种胚每培养28~32天后转接至新的丛芽 诱导培养基中，转接3~4次后，奇楠沉香种胚即可被诱导出多个丛芽。
[0024] 3)增殖培养 将上步诱导出丛芽的奇楠沉香苗接种到继代增殖培养基上，每培养28~32天将种胚 转接至新的继代增殖培养基中继续培养；增殖转接时以3~4个丛芽为1丛，每200mL培 养瓶接种3~4丛。
[0025] 为了研究激素浓度及种类对越南沉香增殖苗的影响，对增殖培养基中的激素浓度 及