一种柽柳组织培养快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及林业科学中的林木组织培养育苗技术领域，涉及一种木本植物组织培养快 速繁殖方法，具体涉及一种柽柳组织培养快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002] 怪柳（71aa?arix cAifleasis Lour.)，又称中国怪柳，为怪柳科（Tamaricaceae)怪柳属 (ramrix L.)中典型的多年生泌盐性木本盐生植物，喜生于河流冲积平原，海滨、滩头、潮 湿盐碱地和沙荒地。其枝、叶、花具有非常高的观赏价值，且具有抗旱、抗盐碱、耐水湿等特 性(张胜利等，2015)，适应性强，不仅是优良的防风固沙植物，同时还是水土保持树种、盐碱 地改良及绿化造林树种，也是我国造林树种中大家公认的头号耐盐树种，植株可耐2. 4%的 盐水浇灌、在土壤含盐为25g/kg的滨海盐渍土上能够正常生长(张立宾等，2008)，而且还 是良好的薪炭、编制和建筑用材；嫩枝及叶药用，能解表利尿、祛风湿、治疗麻疹，其社会经 济和生态效益潜力巨大、开发应用前景十分广阔。但其当前繁殖方式主要以扦插为主，繁殖 规模较小、繁殖系数较低，且受季节性限制，苗木生长参差不齐；目前虽然有组织培养繁育 的相关报道，但多数仅限于科学研究而未应用于生产，影响了柽柳的推广应用。
[0003]目前有少量论文及专利对柽柳组织培养相关技术环节进行了研究，其公开的柽柳 及近缘种短穗柽柳（7： hxa Willd.)组织培养技术中，几乎所有文献资料(程磊等2001 ; 李利红等2005 ;韦小敏等2006ab ;王鹏等2007 ;张永才等2007 ;乔梦吉等2007 ;孙旭旭等 2009)均将柽柳及近缘种组织培养繁殖技术分为无菌苗的获取、启动培养(有的将与无菌苗 获取过程结合称为初代培养)、增殖(继代）培养、生根培养及移栽等五个环节。仅个别文献 资料(韩琳娜等2010、刘伯燕等2015)在概念上探讨了缩短培养周期的一步成苗组织培养 法，但其方法在不违背植物生长规律的情况下，无法回避无菌苗获取(初代培养)、增殖(继 代)、及生根培养等环节，其缩短的培养时间有限、节约成本有限，如果大量缩短时间，苗木 生长量、扩繁量必然较小，进而导致其繁殖系数低、苗木生长受限，协调各阶段状态下的苗 木繁殖效率也无法达到最佳，综合效益无法最大化。省略掉增殖(继代)培养环节，会大幅降 低繁殖系数。当前现有专利(刘伯燕等2015)缺少炼苗移栽环节，无法很好地指导生产。 [0004]自2001年至今，所有公开的柽柳组织培养文献资料中，除个别研究个例（孙旭旭 等2009)使用1/2MS外，基础培养基均为MS培养基，各培养阶段所使用激素限于a-萘乙 酸（NAA)、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA)、激动素（Kt)，个别研究（孙旭旭等2009 )中使用赤霉素 (GA)、吲哚乙酸（IAA)。其中启动培养(初代培养）多使用NAA、6-BA等，增殖(继代）培养多 使用6-BA、Kt等，生根培养中NAA、6-BA、Kt三种激素均有使用。生长激素有多种，且功能清 楚，并具有很多的实践报道。但在柽柳组织培养技术研究的十多年中，仅仅局限在少量的激 素范围内，未见有其他激素的使用，形成了固定模式下的重复性研究，没有大的创新，进而 可能是导致无法突破柽柳组织培养快繁瓶颈、无法应用于生产的主要原因。其他常用激素， 如吲哚丁酸（IBA)可促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进不定 根的形成；玉米素（ZT)不仅能促进侧芽生长、刺激细胞分化，促进愈伤组织发芽，还能抑制 过度根部形成，高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。
[0005] 所报道文献资料中，多使用升汞消毒，不仅易引起无菌苗褐化，而且易给工作人员 造成健康危害、给环境造成污染。因此，十分必要研发一种使用清洁型消毒剂避免引起柽柳 褐化现象、创新型组织培养配方的柽柳组织培养快速繁殖技术，促进柽柳工厂化生产、规模 化推广引用。
【发明内容】
[0006] 为了解决以上现有技术中柽柳组织培养快繁瓶颈、无法应用于生产的问题，本发明提 供了一种柽柳组织培养快速繁殖的方法。
[0007] 本发明是通过以下步骤得到的： 一种柽柳组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤： (1) 无菌苗获得(初代培养） 鲜嫩芽经过处理和杀菌，接于培养基中进行培养，培养基组成为MS培养基中加入6-BA1.0 ~2.0mg/L、IBA0? 05 ~0? 15 mg/L、GA0? 05 ~0? 15 mg/L、蔗糖 20 ~30g/L、琼脂7g/ L，pH值调5. 8~6. 0,培养条件为：在25±2°C，光照12~16h，光强2000~30001x条件下 培养15~20d，获得无菌苗； (2) 继代培养 在无菌条件下将获得的无菌苗接种于继代培养基上进行培养，培养基配方为MS培养 基中加入 ZT0? 3~0? 8mg/L、IBA0? 05~0? 15mg/L、蔗糖20~30g/L、琼脂7g/L，pH值调 5. 8~6. 0,在25±2°C，光照12~16h，光强30001x条件下培养20d，获得丛生芽； (3) 生根培养 在无菌条件下将丛生芽接种于生根培养基上，培养基配方为1\2MS中加入IBA 0. 2~ 0? 5mg/L、NAA 0? 05 ~0? lmg/L、GA 0? 05 ~0? lmg/L、蔗糖 15 ~20g/L、琼脂 7g/L，pH 值调 5. 8~6. 0,在25±2°C，光照12~16h，光强30001x条件下培养30~50d，得到生根组培 苗； (4) 炼苗移栽 将瓶生根完好的柽柳移栽到拱棚中，用遮阳网遮阳，2d后松动瓶盖但不打开瓶盖保持 2d，不出现萎蔫就将瓶盖打开五分之一的缝，之后观察叶片生长情况；待瓶盖完全打开且叶 片生长旺盛时，将柽柳从瓶内移出，洗去根部培养基，放在多菌灵50%可湿性粉剂5g/L溶液 中浸泡45s左右，移栽到装好基质的穴盘中每天浇水使湿度达到90%，缓冲7d，适应自然温 度和湿度，15d，待新根长出后移栽到大田。
[0008] 所述的方法，优选步骤（1)中培养基配方为MS培养基中加入6-BA1.Omg/L、IBA 0? 1mg/L、GA0? 1mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，培养条件为：在25±2°C，光照14h，光强 30001x条件下培养18d。
[0009] 所述的方法，优选步骤（2)中培养基配方为MS培养基中加入ZT0. 5mg/L、IBA0. 1 mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，在25±2°C，光照14h，光强30001x条件下培养20d。
[0010] 所述的方法，优选步骤（3)中培养基配方为1\2MS中加入IBA 0. 5mg/L、NAA 0? lmg/L、GA 0? lmg/L、蔗糖 15g/L、琼脂 7g/L，在 25±2°C，光照 14h，光强 30001x 条件下培 养 45d〇
[0011] 所述的方法，优选步骤（1)中鲜嫩芽经过处理和杀菌的步骤如下： 将鲜嫩芽放在蒸馏水里面浸泡30min，浸泡时加少量洗衣粉和两滴吐温，30min后用 自来水冲洗1~2h，把外植体放到接种台上接种，接种前用75%酒精擦拭接种台，开紫外 30min，在接种台内将柽柳外植体用无菌水冲洗3~5次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用 无菌水冲洗3次，再用2%次氯酸钠杀菌3~9min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。
[0012] 所述的方法，优选步骤（4)中基质为草炭：蛭石体积比3 :1。
[0013] 本发明的有益效果： 1) 利用环境有好的次氯酸钠消毒，克服外植体消毒褐化问题； 2) 并研制出创新型快速继代培养及生根培养培养基配方，制定了简单易行的炼苗移栽 方案，省略了常规方法中的壮苗培养步骤，提高了繁殖效率，使柽柳组织培养快速繁殖技术 从实验室走向生产，实现了柽柳组织培养苗木规模化生产，为柽柳的快繁推广提供了技术 支持。
[0014] 3)此繁殖方法，繁殖系数高，繁殖周期较短，获得的苗木壮、根系较多，移栽成活率 达96%以上。
【附图说明】
[0015] 图1为芽分化， 图2为芽增殖， 图3-1为侧面观生根情况，图3-2为瓶底观生根情况， 图4为闭瓶炼苗， 图5-1为移栽，图5-2为移栽成活， 图6为规模化快繁。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明： 实施例1初代培养基的选择 【1】取材：柽柳外植体取材于大田中刚生长出来的鲜嫩枝芽，取材回来后，选择鲜嫩芽 作为试验材料， 【2】试验材料前处理：放在蒸馏水里面浸泡0. 5h，浸泡时加少量洗衣粉和两滴吐温，随 后用自来水冲洗2h，冲洗后把外植体放到接种台上接种， 【3】接种前准备：接种前，用75%酒精擦拭接种台，开紫外0. 5h。将柽柳外植体用无菌 水冲洗3次，之后用75%酒精浸泡30S，然后用无菌水冲洗3次， 【4】次氯酸钠杀菌：用2%次氯酸钠杀菌处理3min、5min、7min、9min，随后接于以MS培 养基为基础的各种培养基上，发现，上述各种培养基中，杀菌9min情况下，柽柳外植体稍微 变色，其余均正常，将外植体放入组培室培育，每天观察长势以及长菌情况，7min以上抑菌 效果均较好，以7min处理为最好， 【5】培养基筛选：以次氯酸钠杀菌7min，随后将处理好的外植体接于以MS培养基为基 础的10种培养基（A-J)上(见表1)，各培养基pH5. 8。将外植体放入组培室培育，每天观 察长势。具体如下表1。柽柳外植体在大部分培养基中均启动，但是其启动时间、腋芽生长 速度、生长势存在差异，部门腋芽出现一定的变异。以（D)MS+6-BA(1.0mg/L)+IBA(0.1 mg/ L)+GA(0. 1 mg/L) +蔗糖（30g/L) +琼脂（7g/L)培养基中柽柳外植体长势最好。
[0017] 表1柽柳外植体在初代培养基上的生长表现
结论：初代培育中，培养基为 MS+6-BA (L Omg