一种兔耳兰叶片组织培养快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种兔耳兰叶片组织培养快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]兔耳兰(Cymbidium lancifolium)，又名宽叶兰，是英国学者虎克1823年最先发表在《外来植物志》上的一种兰科半附生植物，分布于广东、广西、四川、云南、贵州、中国台湾和西藏等省区，日木、越南、尼泊尔、印度及马来西亚也有分布。
[0003]兔耳兰为国家一级重点保护野生植物。其叶形奇特、花朵秀雅、香气清幽、花色绿白，极具观赏价值中国兰之一。此外，其全草还可入药，全年均可采收，洗净，切段鲜用或晒干用，有润肺补肝、清热解毒、祛风除湿、消肿、强筋骨等作用，主治痈肿疮疖，风湿痹痛，瘰疬，跌打损伤等(何顺志，徐文芬主编，贵州中草药资源研究，贵州科技出版社，2007.9:770 ;云南省药材公司编《云南中药资源名录》:668 ;曾庆文，邢福武，王发国等主编，南岭珍稀植物，华中科技大学出版社，2013.06:88)。因此，兔耳兰具有重要的商业开发价值。
[0004]由于种皮萌芽抑制物质的存在，或种皮本身阻碍水份的渗透，常规播种，兔耳兰种子难以萌发，只有在无菌条件下，借助适宜的培养基质才能实现有性繁殖(祝鹏芳，陈长卿.中国兰的无菌播种与茎尖培养[J].北方园艺.1997 (01):47-48.)。因此，目前兔耳兰主要通过传统的分株繁殖，繁殖系数极低，无法满足规模化人工栽培的需求。
[0005]虽然也有少量兔耳兰及其杂种后代组培相关的研究报道，但主要是以茎尖、(腋)芽或根状茎作为外植体，在基本培养基、植物生长调节剂、有机附加物、切割方式等方面进行过相关优化研究；而且，总体上还存在较多问题，例如:由于外植体较易产生细菌和真菌引起的内部和外部污染、外植体细胞再生能力低、在空气中易变成褐色或枯竭、生长周期长、萌芽和同步生根问题等，组培增殖速度比较缓慢(田英翠，杨柳青.兔耳兰组织培养快速繁殖技术研究.江苏农业科学.2007(02):106-108 ;陈云喜，何丹丹，廖浩如，等.影响墨兰X兔耳兰根状茎芽分化的因素.中国农学通报.2010(09):65-69 ;殷静，续晨.国兰无菌快速繁殖体系的研究进展.安徽农业科学.2010(32): 18071-18073.)。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种兔耳兰叶片组织培养快速繁殖方法，它能够快速繁殖出大量适合移栽的优良兔耳兰种苗，满足生产需要。
[0007]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种兔耳兰叶片组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤:
[0008](1)外植体的选择与消毒:取兔耳兰新萌发的嫩叶作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了 2_3滴吐温-20的100mL0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0009](2)外植体初代诱导与获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀划破叶片表面，接种到MS诱导培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8-10h/d的条件下培养40d，得到无菌试管苗，其中MS诱导培养基为MS 基本培养基中加入 6-BA1.0-5.0mg/L、NAA0.5-2.0mg/L、TDZ0.5-2.0mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基的pH值5.8 ;
[0010](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度为23-27°C、光照强度15001ux，光照时间8_10h/d的条件下培养40d，得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入TDZ0.5-2.0mg/L,NAA0.5-1.0mg/L, KT0.1-0.5mg/L、PVP2mg/L、蔗糖 30g/L 和琼脂 5g/L，培养基 pH 值 5.8 ;
[0011](4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度为23-27°C，光照强度15001ux，光照时间8_10h/d的条件下培养30d，得到健壮植株，其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入NAA0.1-0.5mg/L、6_BA0.5-5.0mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8 ;
[0012](5)生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为23-27°C、光照强度15001ux，光照时间为8_10h/d的条件下培养30d，得到完整带根苗，其中1/2MS生根培养基为MS基本培养基中加入NAA0.5-1.0mg/L、香蕉泥50g/L、蔗糖10g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8 ;
[0013](6)炼苗移栽:将所述完整带根苗在室温为25°C的室内打开瓶盖，瓶内加30mL自来水，炼苗4-7天，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，移栽到灭菌过的椰糠基质中。
[0014]本发明所用椰糠基质为市售品。
[0015]本发明的突出优点在于:
[0016](1)采用生物组织培养技术对兔耳兰的叶片进行快速繁殖，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的兔耳兰幼苗，保障兔耳兰种苗的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
[0017](2)采用本发明得到的兔耳兰丛生芽增殖系数达到10-15倍，丛生芽健壮，接种到生根培养基后容易生根，生根率可达90%以上。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
[0019]实施例1
[0020]本发明所述的兔耳兰的组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0021](1)外植体的选择与消毒:取兔耳兰嫩叶片外植体，去外除叶后，依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了 2_3滴吐温-20的100mL0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3-5次，最后，用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；
[0022](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤(1)得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀划伤叶片表面接种到MS诱导培养基中，培养温度为23-27°C、光照强度15001ux，光照时间8-10h/d的条件下培养40d，得到无菌试管苗。其中MS诱导培养基为MS基本培养基中加入6-BA5.0mg/L, ΝΑΑ0.2mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH 值 5.8 ;
[0023](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10h/d的条件下培养40d，得到试管苗丛生芽。其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入TDZ1.5mg/L、NAA0.2mg/L、KT0.2mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8。丛生芽增殖系数为10.5。
[0024](4)丛生芽壮苗培养:将步骤(3)中得到的丛生芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10h/d的条件下培养30天，得到健壮植株。其中MS壮苗培养基为MS基本培养基中加入6-BA1.5mg/L、NAA0.5mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8。
[0025](5)生根培养:将步骤(4)中得到的健壮植株置于1/2MS生根培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10h/d的条件下培养30天，得到完整带根苗。其中1/2MS生根培养基为1/2MS基本培养基中加入NAA0.5mg/L、香蕉泥50g/L、蔗糖10g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8。生根率90%以上。
[0026](6)炼苗移栽:将所述完整带根苗在室温为25°C的室内打开瓶盖，瓶内加少量自来水，炼苗4-7天，待表面角质形成后，将幼苗取出，洗净根部培养基，立即移栽到灭菌过的椰糠基质中。
[0027]实施例2
[0028]本发明所述的兔耳兰的组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤:
[0029](1)外植体的选择与消毒:取兔耳兰嫩叶片外植体，去外除叶后，依次用2%洗洁精水溶液浸泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了 2_3滴吐温-20的100mL0.1%升汞消毒8-10min、无菌水冲洗3_5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体。其中，无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水。
[0030](2)外植体初代诱导获得无菌试管苗:将步骤⑴得到的外植体置于超净工作台内，用解剖刀划伤叶片表面接种到MS诱导培养基中，培养温度为23-27°C、光照强度15001ux，光照时间为8-10h/d的条件下培养40天，得到无菌试管苗。其中MS诱导培养基为MS基本培养基中加入6-BA5.0mg/L, NAA0.5mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5g/L，培养基pH值5.8。
[0031](3)试管苗丛生芽快速繁殖培养:将步骤(2)中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养基中，在培养温度23-27°C，光照强度15001ux，光照时间为8_10h/d的条件下培养40天，得到试管苗丛生芽。其中MS繁殖培养基为MS基本培养基中加入TDZ1.0mg/L,NAA0.5mg/L、KT0.3mg/L、PVP2mg/L、蔗糖30g/