一种大豆转化不定芽生根的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种大豆转化不定芽生根的方法。
【背景技术】
[0002] 大豆通称黄豆，豆科大豆属一年生草本。原产中国，中国各地均有栽培，亦广泛栽 培于世界各地。大豆是中国重要粮食作物之一，中国东北为主产区，是一种其种子含有丰富 植物蛋白质的作物，大豆最常用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质。豆渣 或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料。
[0003] 20世纪80年代，孟山都公司研究人员从矮牵牛中克隆获得了抗性基因（EPsPs基 因），并用农杆菌介导法将矮牵牛的EPsPs基因导人大豆基因组中，进而培育出抗草甘膦大 豆品种。1994年，孟山都公司培育的抗草甘膦转基因大豆首次获得美国商业化种植许可。 转基因大豆自推广以来，种植面积一直高居各类转基因作物之首，是世界上最早商品化、推 广应用速度最快的转基因作物。
[0004] 大豆转基因要经过基因导入、转化不定芽诱导、不定芽伸长、不定芽生根、植株移 栽生长至开花结荚获得转基因后代。大豆转化不定芽的生根及移栽后的成活率是影响大豆 转基因成功的关键环节之一。在已公开的植物转基因技术中，大豆转化不定芽生根至植株 成熟一般经过以下步骤：（1)将不定芽生切下转移到生根培养基中进行生根培养；(2)从培 养瓶中取出生根的大豆再生苗，洗净根上的培养基，（3)进一步移栽到基质中；继续培育使 新叶发生幼苗健壮；（4)然后移植到土壤中，正常管理直到结荚。在这其中，生根诱导对于 形成完整的植株至关重要，是芽苗能否自主生长的关键步骤，通过再生植株的自主营养吸 收和根毛吸收的养分供应，芽苗才能够健康地生长发育、长成健壮的植株。
[0005] 目前上述生根技术中普遍应用的生根培养基以MS或B5为基本培养基，其中单独 添加吲哚丁酸（IBA)O. 2-1. Omg/L，或者单独添加萘乙酸（NAA)O. 37-1. Omg/L。
[0006] 关于大豆转化不定芽的生根技术的研究，主要有朱木兰等人发明的"大豆转基因 株系混合生根方法"（【申请号】CN201310222316.0)、杨跃生等人发明的"一种解决大豆转化 不定芽条难以生根的无菌嫁接方法"（【申请号】CN201210368585. 3)和姜国勇发明的一种大 豆组织培养分化苗的生根方法（【申请号】CN201410349357. 0)，以上生根技术中均需要在密 闭培养瓶中的无菌培养基上生根。现有技术中，需要配制固体生根培养基，技术复杂且在大 豆不定芽转接到培养基以及后续的培养过程中容易感染细菌，固体生根培养基的培养环境 是在密闭的培养瓶中，不利于再生苗生长的生理代谢，抑制再生苗的发根，并且在固体生根 培养基中培养的不定根与正常根系相比，质量差并且没有根毛，吸收功能差。在瓶内密闭 环境下培育的生根苗存活能力弱，通常要经过瓶外驯化的过程，然后再进行定植，在此过程 中，有一些生根苗因不适应外部环境而死亡，导致移栽成活率降低。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明目的第一目的在于提供一种大豆转化不定芽生根的方法，该方法具有操作 简单、改善生根质量、提高转化大豆不定芽的生根率以及再生大豆苗的成活率等优点。同 时，避免了密封的容器环境对再生苗的发根抑制以及对再生苗生长和生理代谢的不利影 响，避免再生苗在生根过程中染菌，培育出健壮的再生苗。
[0009] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0010] -种大豆转化不定芽生根的方法，包括以下步骤：将大豆转化不定芽的下端浸泡 在生根液中，然后将浸泡后的大豆转化不定芽植入不封闭的育苗钵中，覆膜，进行光照培 养，待长出新叶后，揭膜，继续培养至生根壮苗。
[0011] 本发明提供的大豆转化不定芽生根的方法，可以有效地促进不定根发生。同时可 以抑制后续生根过程中的染菌，尤其是农杆菌的滋生。可以代替现有技术中的固体生根培 养基，固体生根培养基制作过程繁琐、技术复杂，整个过程要求无菌操作，并且，大豆不定芽 转接到培养基以及后续培养过程中容易染菌，尤其是以农杆菌介导的方法转化的大豆，形 成的再生不定芽本身携带农杆菌，不定芽在生根之前或者转移到生根培养基以后容易滋生 农杆菌，染菌后的不定芽不能生根并死亡。该方法中，采用直接在不封闭的育苗钵中（开放 的环境）生根，避免了密封的容器环境对再生苗的发根抑制以及对再生苗生长和生理代谢 的不利影响。固体生根培养基制作过程繁琐、技术复杂，整个过程要求无菌操作。生根液可 以在不定芽植入育苗钵中生根之前代替现有技术中的固体生根培养基，来提供生根所需要 的营养及生根环境，育苗基质透气疏松不利于细菌滋生，因此避免了再生苗生根过程中的 染菌。固体生根培养基质地紧实不透气，在其中生长出的不定根没有根毛，而在育苗钵中育 苗基质接近土壤环境，生长出的根具备丰富的根毛，根毛起着重要的吸收作用。因此该大豆 转化不定芽生根的方法改善了生根质量，培育获得健壮再生苗，从而提高大豆转化不定芽 的生根率、再生大?苗的移栽成活率，最终提尚大?转化成功率。
[0012] 优选的，所述的方法具体包括以下步骤：
[0013] (1)将大豆转化不定芽的下端浸泡在的生根液中；
[0014] (2)将育苗基质装入不封闭的育苗钵中，浇水，然后将步骤（1)中的浸泡过的大豆 转化不定芽植入该装有育苗基质的不封闭的育苗钵中，用薄膜覆盖；
[0015] (3)将步骤（2)中的大豆转化不定芽进行光照培养，待长出新叶后打开覆盖的薄 膜，继续培养该大豆转化不定芽再生苗，直至再生苗健壮。
[0016] 经过生根液浸泡有助于大豆转化不定芽生根，不封闭的育苗钵为不定芽的生根提 供开放的生长环境，使不定芽自然生根，不受拘束，得到健康健壮的根是大豆转化不定芽的 移栽成活率和大豆苗成活的保证。浇水和覆膜提供和保持大豆转化不定芽生根所需水分。 光照为大豆转化不定芽提供光合作用所必须的能量。采用该方法，大豆转化不定芽的生根 率可以达到96. 24%，移栽成活率达到100%。
[0017] 优选的，所述生根液中，包括如下浓度的组分：吲哚丁酸0. 5-2. Omg/L，萘乙酸 0· 2-0. 5mg/L，头孢霉素 200-300mg/L，pH = 5. 5-6. 0。
[0018] 优选的，所述生根液中，包括如下浓度的组分：Π 引哚丁酸0. 5-1. 5mg/L，萘乙酸 0· 2-0. 5mg/L，头孢霉素 240-260mg/L，pH = 5. 7-5. 9。
[0019] 该生根液中的吲哚丁酸是一种良好的生根剂，主要用于插条生根，可诱导根原体 的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形 成，但是，吲哚丁酸在被植物吸收后不易在体内运输，往往停留在所施部位，主要用于促进 插条生根，所生出的根细而疏、分支多；萘乙酸是一种植物生长素，可用于植物组织培养。其 中，萘乙酸有助于促进主根的生成，而吲哚丁酸对于毛细根的形成起到促进作用，两种生长 素单独作用时，效果并不明显，共同作用时效果明显，生根率可以达到96. 24%。两种生长素 在弱酸环境下可以稳定存在。头孢霉素是一种常用的抗生素，可以抑制农杆菌以及其他细 菌的滋生。由于固体生根培养基中所含的生长素释放缓慢，特采用生根液处理不定芽替代 固体生根培养基，可以使不定芽迅速吸收有效成分，并简化操作过程，提高转化大豆不定芽 的生根率。
[0020] 优选的，所述浸泡的时间为5-30分钟。
[0021] 充分的浸泡时间确保了大豆转化不定芽充分吸收生根液中的生长素，促进主根和 毛细根的生长。
[0022] 优选的，所述光