华南紫萁离体再生体系建立的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物技术领域，是一种以孢子囊群为外植体的华南紫萁离体再生体系建立的方法。
【背景技术】
[0002]
华南紫萁{Osmunda vachellii Hook.)是紫萁蕨科紫萁属植物，产于亚洲亚热带湿润地区。分布于我国海南岛、两广、福建、江西、浙江、贵州、云南南部及香港，也产于越南、缅甸和印度。常野生于湿润的山地、草丛或溪边，是我国南部酸性土壤的指示植物。
[0003]华南紫萁具较高的观赏价值。植株高达lm，根状茎直立，圆柱状，叶簇生于顶部，似苏铁，株型美观，叶姿态优雅，可供庭园中栽植或室内盆栽观赏。华南紫萁的根茎及叶柄的髓部可入药，有清热解毒、止血生肌作用。主要用于外感、风热、头痛等症，也可治疗外伤出血、烫火伤、痈疖及腮腺炎。上世纪90年代末，何天士等人将其配制为药酒和药茶供人饮用，对人体保健有积极的作用，可解各种热毒症、预防癌症及其他疑难病症，性味平和，无副作用。相关的研究产品获得4项专利。
[0004]华南紫萁目前资源主要依靠野生，但自然条件下繁殖效率较低，人工繁殖一般采用分株方式进行，难以快速大规模栽培。由于华南紫萁集观赏和药用价值于一身，其潜在的市场需求非常大。利用组织培养技术建立蕨类植物再生体系，快速获得大量种苗，可以满足园林、保健市场对华南紫萁的需求，同时也间接保护了野生华南紫萁资源。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种华南紫萁离体再生体系建立的方法，即以华南紫萁的成熟孢子为外植体，经过外植体表面消毒、孢子无菌萌发、原叶体增殖、孢子体诱导与瓶苗移栽等步骤，建立了华南紫萁离体再生体系，从而快速可持续地获得大量种苗。
[0006]本发明采用下述技术方案来实现。华南紫萁离体再生体系建立的方法，包括以下步骤:
(1)外植体采集与表面消毒:剪取华南紫萁孢子叶，进行表面消毒。
[0007](2)孢子无菌萌发:分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养。孢子萌发培养基配方为:改良Beneck基本培养基+ 0~15g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L + 2,4 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.lmg/L+琼脂 7g/L
(3)原叶体增殖培养:将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次增殖培养基。增殖培养基配方为:改良Beneck基本培养基+ 15g/L 蔗糖 + 6-BA 0-0.6mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 琼脂 7g/L。
[0008](4)孢子体的诱导:将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配方为:改良Beneck基本培养基+赤霉素(GA3)0~1.2mg/L +5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
[0009](5)生根培养与炼苗:将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。生根培养基配方为:改良Beneck基本培养基+10g/L鹿糖+ 6-BA0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L (或NAA0.lmg/L) +琼脂7g/L发现不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。
[0010](6)移栽:取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。
[0011]上述改良Beneck 基本培养基配方为:NH4N03 2 00mg/L、KH2P04 1 00mg/L、MgS04.7H20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4H20 22.3mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HZ0 0.25 mg/L、CuS04.5H20 0.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2H20 9.325 mg/L。琼脂培养基pH值均调节至5.8。
[0012]上述培养条件均为:12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2°C。
[0013]上述步骤(1)中表面消毒条件优选如下:先用70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1% 升汞(HgCl2)消毒 2min。
[0014]上述步骤(2)孢子萌发培养基配方优选为:改良Beneck基本培养基+ 5g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L + 2,4 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.lmg/L+琼脂 7g/L
上述步骤(3)中，增殖培养基配方优选为:改良Beneck基本培养基+ 15g/L鹿糖+6-BA 0.6mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 琼脂 7g/L。
[0015]上述步骤(4)中，孢子体诱导培养基配方优选为:改良Beneck基本培养基+赤霉素(GA3)0.8mg/L +5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。接种方式优先为粉碎性接种。
[0016]上述步骤(5)中，生根培养基配方优选为:改良Beneck基本培养基+10g/L鹿糖+6-BA 0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 琼脂 7g/L。
[0017]本发明首次建立了华南紫萁离体再生体系的方法，填补了现有技术空白；使用本发明的快速繁殖的方法，可实现高度集约化和高密度工厂化生产，可在短时期内获得大量优质的华南紫萁幼苗，为园艺生产和中药栽培提供的可靠的技术保障。
【附图说明】
[0018]图1华南紫萁原叶体增殖效果图。
[0019]图2华南紫萁孢子体诱导效果图。
[0020]图3华南紫萁移栽效果图。
【具体实施方式】
[0021]准备工作:按配方制备改良Beneck基本培养基，其配方为:NH4N03 2 00mg/L、KH2P04100mg/L、MgS04.7Η20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4Η2022.3 mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HZ0 0.25 mg/L、CuS04.5H20 0.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2H20 9.325 mg/L。琼脂培养基pH值均调节至5.8。
[0022]本发明提供的华南紫萁离体培养体系建立的方法，包括如下顺序步骤:
(1)外植体采集与表面消毒处理:在华南紫萁孢子囊群色泽黄褐，孢子叶轴尚呈黄绿新鲜状态时，剪取孢子叶自封袋中带回，及时处理新鲜材料，或贮4°C保存，2d内处理完。孢子叶表面消毒:孢子叶剪裁为3~4cm的小段，置50ml广口瓶中，饱和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐温-80，盖瓶盖，浸洗20min，期间每3~5min轻轻旋摇瓶体数次；自来水缓缓冲洗孢子叶lOmin ;在超净工作台上，弃瓶内自来水，加入70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1%HgCl2消毒2min，再以无菌水冲洗5次，备用。
[0023](2)孢子无菌萌发:分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养。孢子萌发培养基配方为:改良Beneck基本培养基+ 0~15g/L蔗糖+6-BA 0.2mg/L + 2，4-D 0.lmg/L+琼脂7g/L。培养条件均为:12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2°C。
[0024](3)原叶体增殖培养:将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次增殖培养基。增殖培养基配方为:改良Beneck基本培养基 + 15g/L 蔗糖 + 6-BA 0-0.6mg/L +2, 4-D 0.lmg/L+琼脂 7g/L。培养条件均为:12h 光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2°C。
[0025](4)孢子体的诱导:将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配配方为:改良Beneck基本培养基+ GA3 0-1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。培养条件均为:12h光照+12h黑暗，光照强度 2500Lx，25±2°C。
[0026](5)生根培养与炼苗:将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。生根培养基配方为:改良Beneck基本培养基+10g/L鹿糖+ 6-BA
0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L (或 NAA0.lmg/L) + 琼脂 7g/L。10_15d 陆续发现各幼孢子体不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。培养条件均为:12h光照+12h黑暗，光照强度2500LX，25±2°C。
[0027](6)移栽:取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中，基质为草炭:蛭石=3: 1。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。
[0028]以下结合实施例对本发明作进一步详细、完整说明:
实施例1
外植体采集与表面消毒处理:在华南紫萁孢子囊群色泽黄褐，孢子叶轴尚呈黄绿新鲜状态时，剪取孢子叶自封袋中带回，及时处理新鲜材料，或贮4°C保存，2d内处理完。孢子叶表面消毒:孢子叶剪裁为3~4cm的小段，含10-12个孢子囊群，置50ml广口瓶中，饱和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐温-80，盖瓶盖，浸洗20min，期间每3~5min轻轻旋摇瓶体数次；广口瓶口扎以纱布，以自来水缓缓冲洗孢子叶lOmin，至瓶内液体澄清；在超净工作台上，弃瓶内自来水，加入70%的酒精浸泡15s，弃酒精，加入0.1%取(:12消毒2min，再以无菌水冲洗5次，备用。分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养，每瓶接种10个孢子囊群。培养条件均为:12h光照+12h黑暗，光照强度2500Lx，25±2°C。
[0029]孢子萌发培养基配方为: a)改良 Beneck 基本培养基 + 0/L 鹿糖+6-BA 0.2mg/L + 2, 4-D 0.lmg/L+琼脂 7g/L。
[0030]b)改良 Beneck 基本培养基 + 5g/L