一种铁皮石斛的组培快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物种植，特别涉及一种铁皮石斛的组培快繁方法。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛，为兰科多年生附生草本植物。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石 上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐一 5°C的低温。石斛可分为黄 草、金钗、马鞭等数十种，铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛具有 独特的药用价值，以其茎入药，中药名：石斛，属补益药中的补阴药，《中国药典》：益胃生津， 滋阴清热。铁皮石斛等少数品种之嫩茎，扭成螺旋状或弹簧状，晒干，商品称为耳环石斛，又 名楓斗。
[0003] 从组培室到设施或田间栽培之前一定要经过炼苗这一重要环节，传统的炼苗方 法通常是瓶苗先经过室内环境适应一段时间（一般5-10天)，逐渐打开瓶盖进行过渡（3-5 天)，然后再出瓶、洗掉培养基，给予高湿（90%以上湿度)、弱光处理进行正常栽培前的过渡 炼苗。组织培养（Tissue Culture)是在无菌条件下，分离并在培养基中培养离体植物组 织的技术，它具有以下重要意义：（1)促进优良遗传材料的快速繁殖；（2)脱毒良种苗的培 养和无病毒苗的大量繁殖；（3)特殊育种材料的快速繁殖；（4)基因工程植株的快速繁殖； (5)离体保存种质的快速繁殖。
[0004] 有关针对铁皮石斛组织培养和快速繁殖的公开文献报道也有很多，经检索摘录如 下： 1、【题名】铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进展【作者】魏丽芳；于桂芬；冯国宝；杨 亚平【机构】潞安矿业(集团）有限责任公司林业处【刊名】安徽农业科学，2013,41 (35)【文 摘】铁皮石斛（Dendrobium candidum Wall, ex Lindl.)是我国传统名贵中药材，自然繁 殖率低，野生资源稀缺，近些年对其人工快繁技术研究进展较快。从外植体、原球茎增殖与 分化、生根与壮苗、移栽等方面对铁皮石斛组织培养与快速繁殖研究进行了综述。提出当前 研究存在的问题：种苗培养周期较长，成本较高；大田移栽技术研究相对薄弱，移栽后的种 苗成活率较低；对于种苗培养过程中药用有效成分积累规律的研究较少。针对当前研究存 在的不足，指出今后的研究方向：加强光照、温度、湿度等环境条件与原球茎增殖分化相关 性研究，缩短种苗培养周期，提高生产效率；加强大田移栽技术基础研究，提高移栽成活率； 加强组织培养过程中种苗药用有效成分积累规律以及与培养条件关系研究，提高种苗药用 有效成分含量。该研究可为铁皮石斛规模化生产提供参考。
[0005] 2、【题名】铁皮石斛组织快繁及移栽培养【作者】翟明恬；刘红霞；王亚妮【机构】潞 安矿业(集团）有限责任公司林业处【刊名】东北林业大学学报，2015年第43卷第1期【文 摘】摘要为了筛选出铁皮石斛的最佳组织培养培养基、最佳移栽基质、最适菌剂种类和施用 方式，选取具有1-2片叶片的铁皮石斛分化苗在3种常用组培培养基上培养.11周后，统计 平均株高、茎粗、根长、鲜质量的增长量、平均产生新根数、新孽数：选取相同长势的铁皮石 斛组培苗，在2种常用兰科植物培养基质上移栽，将3株优良兰科菌根真菌制成4g. L-1的 单一液体菌剂，对铁皮石斛移栽苗分别进行蘸根、灌根，90 d后，统计成活率、平均鲜质量、 株高、茎粗增长量、平均新根数。结果显示：MS+0. 34 9. L。'KN0，+100 9. L-1 土豆提取液 +2.4 9. L"植物凝胶+30 9. L-I蔗糖培养基上生长的铁皮石斛苗平均株高增长量、平均鲜 质量增长量、平均新根数、平均分蘖数极显著大于其他两组处理；移栽于V (珍珠岩）：V (仙 土）：矿(松树皮）(活苔藓1=1 :1 :1 :2基质上的铁皮石斛幼苗除平均新芽数略低于移栽 于V (花生壳）：V (石灰岩）：V (蛭石）：V (活苔藓）=1 :1 :1 :2基质上的铁皮石斛幼苗外，其 他生长指标均高于后者，其中新根数显著高于后者：施用Dh57茵剂的铁皮石斛幼苗在成活 率、平均新根数、生长量方面显著高于施用D〇60、Ph03茵剂的铁皮石斛幼苗。在株高、茎粗 增长量方面极显著高于另外4组处理：施用Ph03菌剂的铁皮石斛幼苗平均新芽数极显著高 于施用Dh57、D〇60茵剂的处理组：同一菌剂蘸根处理的幼苗生长指标均高于灌根处理。
[0006] 可见，目前虽然对于铁皮石斛组织培养技术研究较多，但有目的性的针对铁皮石 斛的优良性状进行扩繁，同时能有效推广应用的组培快繁方法还有很多工作需要摸索，由 于铁皮石斛是珍贵药材，对于其的快速繁殖，满足市场供应，提高其经济效益具有重要意 义。
【发明内容】
[0007] 本发明目的是克服现有铁皮石斛繁殖方法不足之处，提供一种操作难度低、繁殖 系数高、防治周期短、能稳定遗传且成活率高的铁皮石斛的组培快繁方法。
[0008] 本发明一种铁皮石斛的组培快繁方法，其特征在于：它包括以下步骤： ① 外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面 8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为3-5cm，带有1-2个腋芽的小茎段作为外 植体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回 的莖段去除大部分叶片后，用自来水冲洗l〇min，0. 5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水 冲洗干净； ② 外植体消毒：步骤①得到的外植体用75%的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4-5次，沥干 水，然后置于〇. 1 %的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗4-5次； ③ 初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成 分为：MS+ NAAL 5mg/L+6-BA2mg/L+5%糖蜜，培养基ρΗ5· 6 ;光照强度1500Lux，培养温度 25 ±2 °C，培养时间45天； ④ 继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分 为：MS+6-BA6mg/L+NAA0. 5mg/L+0. 05% 氨基寡糖素 +8% 糖蜜 + 150mg/L 土豆；培养温度 25±2°C，光照时间15h/d，培养基pH 5. 6-5. 8 ;光照强度2000Lux，培养30天，形成2cm长的 具有3个茎节的芽条，将其切成带茎节的切段，每个芽分割成2段；每30天如此继代一次， 扩繁试管苗； ⑤ 生根培养：待步骤④扩繁的试管苗取出，转入生根培养，生根培养基成分为： MS+NAA 0· 5mg/L+6-BA4mg/L+2. 0% 氨基寡糖素 +18% 糖蜜 +200mg/L 土豆；光照强度为 3000Lux，培养温度25 ±2°C，培养至25天，根长至2cm，苗长高3cm时出瓶； ⑥ 炼苗：选择健壮、株茎粗壮的试管苗出瓶，清水清洗根部，移栽在泥炭土：椰糠配比 为1:3的营养基质中，保持空气湿度85-95%，光照120001UX ; ⑦移栽：炼苗15天后移到露天培养。
[0009] 所述的铁皮石斛的组培快繁方法还包括组培苗移栽后的管理，具体为：移栽前，将 组培苗在定根水中浸泡l_2h ;施足基肥，及时追肥，并及时防治病虫害。
[0010] 所述定根水组成为：3%甲霜灵+3%恶霉灵+0. 05%吲哚丁酸+0. 05%萘乙酸钠+0. 5% 聚丙稀酸钠+纯净水余量。
[0011] 所述防治病虫害为：防治病害是黄斑病、炭疽病、叶枯病或花叶病；防治虫害是石 斛菲盾蚊、蜗牛或地老虎。
[0012] 本发明与已有技术相比，其突出的实质性特点和显著的进步是： 1、本发明铁皮石斛的组培快繁方法操作难度低、生产成本低，易于在大范围内推广使 用。在大规模组织培养过程中，培养基使用糖蜜作为重要成分，替代了蔗糖，直接降低了培 养基的成本；同时，培养基中氨基寡糖素在培养基中的适量使用有效抑制了杂菌侵染，减少 组培风险，是较为成熟可靠安全的组培快繁方法。
[0013] 2、本发明铁皮石斛的组培快繁方法生产的组培苗成活率高，铁皮石斛组培苗成活 率在98%以上。
【具体实施方式】
[0014] 以下是结合实施例对本发明进一步详细说明： 实施例一： 本发明一种铁皮石斛的组培快繁方法，其特征在于：它包括以下步骤： ① 外植体的建立：选择3年龄，生长健壮、株茎粗大、无病虫害的优良植株，从离地面 8-12cm处截断，取茎部上段，再将茎段切成长度为3cm，带有1-2个腋芽的小茎段作为外植 体材料；为减少材料污染源，采取茎段时，应选择连续三天以上晴好天气后进行；将采回的 莖段去除大部分叶片后，用自来水冲洗l〇min，0. 5%洗衣液溶液浸泡20min，再用自来水冲 洗干净； ② 外植体消毒：步骤①得到的外植体用75%的酒精浸泡30S，无菌水冲洗4次，沥干水， 然后置于0. 1 %的升汞溶液中消毒15min，无菌水冲洗4次； ③ 初代培养：将步骤②处理过的茎段在无菌条件下接种到初代培养基，初代培养基成 分为：MS+ NAAL 5mg/L+6-BA2mg/L+5%糖蜜，培养基ρΗ5· 6 ;光照强度1500Lux，培养温度 25 ±2 °C，培养时间45天； ④ 继代培养：初代培养至腋芽萌发成丛芽，取丛芽进行继代培养，继代培养基成分 为：MS+6-BA6mg/L+NAA0. 5mg/L+0. 05% 氨基寡糖素 +8% 糖蜜 + 150mg/L 土豆；培养温度 25±2°C，光照时间15h/d，培养基pH 5. 6 ;光照强度