一种白芨组培快繁方法及运用
【专利摘要】本发明公开了一种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：外植体灭菌方法、白芨种子无菌萌发、种胚形态及种胚突破种皮过程观察、白芨的组培快繁和用TTC法测定白芨种子活力。本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产，应用价值高。
【专利说明】
一种白芨组培快繁方法及运用
技术领域
[0001] 本发明涉及中药材种植技术领域，更具体地说，尤其涉及一种白芨组培快繁方法。 同时，本发明还涉及一种白芨抗氧化的运用。
【背景技术】
[0002] 白芨，属兰科植物白芨属的一种，为多年生草本植物，具有较高的观赏价值;其干 燥假鳞茎为我国民间传统中药材，具有极高的药用价值，其味苦、甘、涩，性凉，归肺、胃、肝 经。功能收敛止血、消肿生肌，主治肺胃出血、外伤出血、痈肿疮疡、皮肤毅裂、水火烫伤等。 白芨较高的观赏价值和极高的药用价值，导致市场需求量不断增长，据不完全统计，目前白 芨市场需求量己达到4000吨以上，其中药厂使用量为2000余吨(其中葵花药业月需求80吨， 年需求1000余吨；江中制药需求30吨）；出口韩国、台湾和香港50吨/月，主要用于化妆品生 产;全国医院药房等50吨/月。长期以来白芨中药材主要以野生为主，随着需求量的增加，导 致野生白芨被过度采挖；同时，由于自然生境的破坏也加剧了野生白芨资源的减少，野生白 芨己濒临灭绝，己被中国列为重点保护的野生药用植物之一。白芨的可持续利用己引起人 们的关注，但白芨种子自然萌发率低，目前主要以分株方式进行繁殖，繁殖率低、繁殖速度 慢；白芨每个萌果具有数万粒种子，采用种子进行组培快繁，可短期内大量繁殖种苗，是解 决白芨种苗问题的必由之路，但组培苗炼苗栽培技术还不成熟，组培苗移栽成活率低且周 期长，己成为白芨产业化的瓶颈，通过了解白芨的自然萌发生长特性，在此基础上研究制定 组培苗及移栽技术是解决这一瓶颈的关键。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种白芨组培快繁方 法及运用。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0005] -种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：
[0006] S1、外植体灭菌方法:首先用流水冲洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面， 用蒸馏水冲洗2-3遍，在超净工作台上先用75%酒精消毒2-3min，再用10%次氯酸钠溶液浸 泡8-12min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4-6遍，无菌滤纸吸干表面水分待 用；
[0007] S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表 面；
[0008] S3、白芨种子无菌萌发:基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉 6.5g/L;培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；
[0009] S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121°C下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌 发培养基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球茎、叶片诱导培养基见表1;白芨生根培养基MS+ NAA l.Omg/L;置于光强2000-25001x，光周期16h/8h，温度23-27°C的条件下培养；
[0010] S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察:接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学 显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有 胚率表示，结果取平均值，有胚率=(有胚的种子数/总种子数）x 100%;
[0011] S6、白芨的组培快繁:将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切， 叶片切割长度在〇. 35-0.6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；
[0012] S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反 应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或 NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF);如果种胚死亡或种胚生 活力衰退，则不能染色或染色较浅。
[0013] 优选的，
[0014]在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：
[0015]选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管 中至0.25ml刻度处，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管 吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚 率和种子活力，各样品重复3次;有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着 色。
[0016] 优选的，在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7. Og/L，pH 5.8，碳 源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量 为30g/L;处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L;处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L;处理4的 碳源为葡糖糖，用量为60g/L;处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可 溶性淀粉，用量为60g/L;每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在 OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。
[0017] 优选的，本发明采用组培瓶规格为240ml高90mm直径68mm口径62mm，培养基的添加 量均为30ml。
[0018] 本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，
[0019]( - )对铁原子还原能力的影响：
[0020] 以lmg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液;分别取供试品溶液和对 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸缓冲溶 液0.5mL，再加1 %铁氰化钾0.5mL;混合均匀后，50°C水浴20min;水浴结束后，再每只试管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，离心（3000转/分钟）101]1；[11 ;离心结束后，取上清液11]1]^，加入蒸馏 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化铁;将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化铁改成0. lmL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度;平行3份;将上述加入的 药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；
[0021] (二)对DPPH清除能力的影响：
[0022] 取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入适量甲醇至体积为2.425111以即用移液枪精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波 长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下 公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC5Q;同时，以lmg/mL的没食子酸为 阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC50;
[0023] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0024] 本发明提供的一种白芨组培快繁方法，与现有技术相比：
[0025]第一，本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。本培养方法 出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产，应用价值高；
[0026] 第二，白芨的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素 的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制白芨的质量；
[0027] 第三使用本发明提供的快繁技术得到白芨幼苗，进行人工栽培，移栽成活率比组 培苗要高，更能快速适应自然环境，能缩短白芨种植年限。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本 发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0029] 实施例1
[0030] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0031 ] -种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：
[0032] S1、外植体灭菌方法:首先用流水冲洗蒴果26min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 馏水冲洗2遍，在超净工作台上先用75 %酒精消毒2min，再用10 %次氯酸钠溶液浸泡8min， 期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；
[0033] S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表 面；
[0034] S3、白芨种子无菌萌发:基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉 6.5g/L;培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；
[0035] S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121°C下灭菌12min，每处理4次重复；白芨萌发 培养基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球茎、叶片诱导培养基见表1;白芨生根培养基MS+ NAA l.Omg/L;置于光强2000-25001x，光周期16h/8h，温度23-27°C的条件下培养；
[0036] 在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L; 处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L;处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L;处理4的碳源为葡 糖糖，用量为60g/L;处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉， 用量为60g/L;每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格 为240ml高90mm直径68mm 口径62mm，培养基的添加量均为30ml。
[0037] S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察:接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学 显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有 胚率表示，结果取平均值，有胚率=(有胚的种子数/总种子数）x 100%;
[0038] S6、白芨的组培快繁:将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切， 叶片切割长度在ο. 35，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；
[0039] S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反 应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或 NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF);如果种胚死亡或种胚生 活力衰退，则不能染色或染色较浅。
[0040] 在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：
[0041] 选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管 中至0.25ml刻度处，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管 吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚 率和种子活力，各样品重复3次;有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着 色。
[0042] 本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，
[0043]( - )对铁原子还原能力的影响：
[0044]以lmg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液;分别取供试品溶液和对 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸缓冲溶 液0.5mL，再加1 %铁氰化钾0.5mL;混合均匀后，50°C水浴20min;水浴结束后，再每只试管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，离心（3000转/分钟）101]1；[11 ;离心结束后，取上清液11]1]^，加入蒸馏 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化铁;将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化铁改成0. lmL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度;平行3份;将上述加入的 药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；
[0045](二)对DPPH清除能力的影响：
[0046] 取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入适量甲醇至体积为2.425111以即用移液枪精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波 长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下 公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC 5Q;同时，以lmg/mL的没食子酸为 阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC 50;
[0047] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0048] 实施例2
[0049] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0050] -种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：
[0051] S1、外植体灭菌方法:首先用流水冲洗蒴果28min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 馏水冲洗3遍，在超净工作台上先用75 %酒精消毒3min，再用10 %次氯酸钠溶液浸泡lOmin， 期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；
[0052] S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表 面；
[0053] S3、白芨种子无菌萌发:基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉 6.5g/L;培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；
[0054] S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121°C下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌 发培养基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球茎、叶片诱导培养基见表1;白芨生根培养基MS+ NAA l.Omg/L;置于光强2000-25001x，光周期16h/8h，温度26°C的条件下培养；
[0055] 在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0.2g/L，琼脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L; 处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L;处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L;处理4的碳源为葡 糖糖，用量为60g/L;处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉， 用量为60g/L;每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格 为240ml高90mm直径68mm 口径62mm，培养基的添加量均为30ml。
[0056] S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察:接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学 显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有 胚率表示，结果取平均值，有胚率=(有胚的种子数/总种子数）x 100%;
[0057] S6、白芨的组培快繁:将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切， 叶片切割长度在〇. 5，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；
[0058] S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反 应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或 NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF);如果种胚死亡或种胚生 活力衰退，则不能染色或染色较浅。
[0059] 在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：
[0060] 选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管 中至0.25ml刻度处，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管 吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚 率和种子活力，各样品重复3次;有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着 色。
[0061 ]本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，
[0062]( - )对铁原子还原能力的影响：
[0063]以lmg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液;分别取供试品溶液和对 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸缓冲溶 液0.5mL，再加1 %铁氰化钾0.5mL;混合均匀后，50°C水浴20min;水浴结束后，再每只试管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，离心（3000转/分钟）101]1；[11 ;离心结束后，取上清液11]1]^，加入蒸馏 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化铁;将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化铁改成0. lmL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度;平行3份;将上述加入的 药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；
[0064](二)对DPPH清除能力的影响：
[0065]取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入适量甲醇至体积为2.425111以即用移液枪精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波 长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下 公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC5Q;同时，以lmg/mL的没食子酸为 阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC 50;
[0066] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0067] 表1白芨对铁原子还原能力结果
[0068]
[0070] 实验研究结果表明，随着加药量的增加，吸光度值逐渐增加，还原能力增加，表明 白及块茎和须根以及阳性对照没食子酸均是良好的电子供应者，供应的电子可以使体系中 的Fe+还原成Fe} +，还可以与自由基结合成为较为惰性的物质，以中断自氧化链锁反应，结 果见下表。从实验结果可以看出，普通方式繁殖的白及与组培方式繁殖的白及对铁原子还 原能力没有统计学差异。
[0071] 表2白芨对DPPH自由基清除能力结果
[0072]
[0073]考察白及对DPPH自由基的清除能力，结果发现白及对DPPH具有较强的清除能力， 并呈一定的量效关系。不同繁殖方式得到的白及药材对DPPH自由基的清除能力没有统计学 差异。
[0074] 实施例3
[0075] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0076] -种白芨组培快繁方法，具体包括以下步骤：
[0077] S1、外植体灭菌方法:首先用流水冲洗蒴果32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 馏水冲洗3遍，在超净工作台上先用75 %酒精消毒3min，再用10 %次氯酸钠溶液浸泡12min， 期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗6遍，无菌滤纸吸干表面水分待用；
[0078] S2、在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表 面；
[0079] S3、白芨种子无菌萌发:基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉 6.5g/L;培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物；
[0080] S4、培养基高温灭菌前调pH至5.4，121°C下灭菌20min，每处理4次重复；白芨萌发 培养基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球茎、叶片诱导培养基见表1;白芨生根培养基MS+ NAA l.Omg/L;置于光强2000-25001x，光周期16h/8h，温度27°C的条件下培养；
[00811 在S4中，以MS为基本培养基，添加活性炭0 · 2g/L，琼脂7 · Og/L，pH 5 · 8，碳源(蔗糖、 葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L，60g/L);共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L; 处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L;处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L;处理4的碳源为葡 糖糖，用量为60g/L;处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉， 用量为60g/L;每种处理重复30瓶。每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。本发明采用组培瓶规格 为240ml高90mm直径68mm 口径62mm，培养基的添加量均为30ml。
[0082] S5、种胚形态及种胚突破种皮过程观察:接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学 显微镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有 胚率表示，结果取平均值，有胚率=(有胚的种子数/总种子数）x 100%;
[0083] S6、白芨的组培快繁:将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切， 叶片切割长度在〇. 6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果；
[0084] S7、用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反 应，而死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或 NADPH2)上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF);如果种胚死亡或种胚生 活力衰退，则不能染色或染色较浅。
[0085]在S7中，所述TTC法测定白芨种子活力的具体过程如下：
[0086] 选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管 中至0.25ml刻度处，加入1 % TTC溶液lml在30 °C黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管 吹吸使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚 率和种子活力，各样品重复3次;有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着 色。
[0087] 本发明还提供一种白芨抗氧化的运用，
[0088]( - )对铁原子还原能力的影响：
[0089]以lmg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液;分别取供试品溶液和对 照品溶液0 · 05、0 · 1、0 · 15、0 · 2、0 · 25、0 · 3mL，加甲醇至0 · 3mL，各加入PH = 6 · 6的磷酸缓冲溶 液0.5mL，再加1 %铁氰化钾0.5mL;混合均匀后，50°C水浴20min;水浴结束后，再每只试管中 加入10%三氯乙酸0.51]1]^，离心（3000转/分钟）101]1；[11 ;离心结束后，取上清液11]1]^，加入蒸馏 水lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化铁;将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化铁改成0. lmL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度;平行3份;将上述加入的 药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照；
[0090] (二)对DPPH清除能力的影响：
[0091] 取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入适量甲醇至体积为2.425111以即用移液枪精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波 长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下 公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC 5Q;同时，以lmg/mL的没食子酸为 阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC 50;
[0092] 清除率（％ ) = (Adpph~A|_)/AdpphX 100% 〇
[0093] 综上所述:第一，本发明方法获得的白芨苗方法简单，而且大大降低了育苗成本。 本培养方法出芽快，增殖率高，方法简单，不需要增加组培设备，生产成本低，可批量生产， 应用价值高；
[0094] 第二，白芨的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素 的制约，可排除病虫害的侵袭和农药残留的影响，严格控制白芨的质量；
[0095] 第三使用本发明提供的快繁技术得到白芨幼苗，进行人工栽培，移栽成活率比组 培苗要高，更能快速适应自然环境，能缩短白芨种植年限。
[0096] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种白芨组培快繁方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 51、 外植体灭菌方法:首先用流水冲洗蒴果26-32min，用洗衣粉水刷洗蒴果表面，用蒸 馏水冲洗2-3遍，在超净工作台上先用75 %酒精消毒2-3min，再用10 %次氯酸钠溶液浸泡8-12min，期间不停的摇动，使其消毒彻底，无菌水冲洗4-6遍，无菌滤纸吸干表面水分待用； 52、 在无菌条件下剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子轻轻抖落到培养基表面； 53、 白芨种子无菌萌发:基本培养基采用MS特殊说明外，均添加蔗糖30L和琼脂粉6.5g/ L;培养基按试验设计在灭菌前添加不同的生长调节剂或有机物； 54、 培养基高温灭菌前调pH至5.4，121°C下灭菌12-20min，每处理4次重复；白芨萌发培 养基：（1 )MS; (2)MS+NAA 1. Omg/L;原球茎、叶片诱导培养基见表1;白芨生根培养基MS+NAA l.Omg/L;置于光强2000-25001x，光周期16h/8h，温度23-27°C的条件下培养； 55、 种胚形态及种胚突破种皮过程观察:接种剩余种子在NIKON ECLIPSE 55i光学显微 镜10倍物镜下观察种子胚形态和发育状况，每个蒴果观察20个视野并统计数据，以有胚率 表示，结果取平均值，有胚率=(有胚的种子数/总种子数）X 100% ; 56、 白芨的组培快繁:将种子无菌萌发诱导的原球茎及叶片切割后，原球茎纵切，叶片 切割长度在〇. 35-0.6，分别接种到诱导培养基上，观察其诱导分化结果； 57、 用TTC法测定白芨种子活力：活种子的胚在呼吸作用过程中进行氧化还原反应，而 死种子则无此反应；当TTC渗入活种子胚细胞内作为氢受体而被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2) 上的氢还原时，无色的TTC转变为红色的三苯基甲腙(TTF);如果种胚死亡或种胚生活力衰 退，则不能染色或染色较浅。2. 根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于:在S7中，所述TTC法测定白 芨种子活力的具体过程如下： 选择成熟饱满的蒴果，将各蒴果种子取出混合均匀，取适量种子加入1.5ml离心管中至 0.25ml刻度处，加入1%TTC溶液lml在30°C黑暗放置48h，然后染色48h后，用胶头滴管吹吸 使种子混匀，吸取种子转移至载玻片上，用滤纸吸去染液，体式显微镜下统计种子有胚率和 种子活力，各样品重复3次;有活力种子胚将被染为橙色或者红色，无活力种子胚不着色。3. 根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于:在S4中，以MS为基本培养 基，添加活性炭〇. 2g/L，琼脂7. Og/L，pH 5.8，碳源(蔗糖、葡萄糖、可溶性糖)添加量(30g/L， 60g/L);共6个处理，处理1的碳源为蔗糖，用量为30g/L;处理2的碳源为蔗糖，用量为60g/L; 处理3的碳源为葡萄糖，用量为30g/L;处理4的碳源为葡糖糖，用量为60g/L;处理5的碳源为 可溶性淀粉，用量为30g/L:处理5的碳源为可溶性淀粉，用量为60g/L;每种处理重复30瓶。 每次观察随机取3瓶，每瓶观察6个视野，在OLYMPUS SZX-16体式显微镜下观察，并用Canon G12数码相机拍照保存图片资料。4. 根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于:本发明采用组培瓶规格为 240ml高90mm直径68mm 口径62mm，培养基的添加量均为30ml。5. -种权利要求1所述的白芨抗氧化的运用，其特征在于： (一)对铁原子还原能力的影响： 以lmg/mL没食子酸为阳性对照，稀释20后为对照品溶液;分别取供试品溶液和对照品 溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加甲醇至0.31^，各加入?!1 = 6.6的磷酸缓冲溶液 0.5mL，再加1 %铁氰化钾0.5mL;混合均匀后，50 °C水浴20min;水浴结束后，再每只试管中加 入10 %三氯乙酸0.5mL，离心（3000转/分钟）lOmin;离心结束后，取上清液lmL，加入蒸馏水 lmL，再加入0. lmL 0.1 %三氯化铁;将上述步骤中的药物换成对应容积的甲醇，最后加的 0. lmL 0.1 %三氯化铁改成0. lmL蒸馏水为空白，700nm测定吸光度;平行3份;将上述加入的 药物换成对应体积的甲醇，按上述方法制备阴性对照； (二)对DPPH清除能力的影响： 取白及块茎醇提物稀释40倍，白及须根醇提物稀释200倍。然后分别取稀释液0.05、 0.1、0.15、0.2、0.25、0.311^，加入适量甲醇至体积为2.42511^(即用移液枪精密吸取 2.375mL，2.325mL，2.275mL，2.225mL，2.175mL，2.125mL的甲醇），加入0.075m LDPPH(取 DPPH 25mg，加甲醇定容至50mL即可），立即混勾；以甲醇为空白，全波长扫描，在最大吸收波 长处测定吸光度；同时，取2.425mL的甲醇，加入0.075mLDPPH测定吸光度记为ADPPH。按以下 公式计算清除率，并计算白及块茎和须根的半数抑制率IC 5Q;同时，以lmg/mL的没食子酸为 阳性对照，稀释20倍，按上述操作，计算没食子酸的清除率和半数抑制率IC 50; 清除率（％ ) = (Adpph-A|5^)/AdpphX 100% 〇
【文档编号】A61K36/898GK106035088SQ201610436028
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】黄帅
【申请人】丽江海贝瑞生物科技有限公司