黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法。

背景技术：

植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。植物合成和积累的次生代谢物被广泛应用于药品、食品和化妆品等行业。我国是世界上药用植物资源最丰富的国家之一，随着中医药产业的快速发展，国内、外对中药资源的需求在迅速增加，我国每年也有大量来源于药用植物的提取物出口到世界各地，这些都加速着我国中药资源的消耗，给濒危的药用植物资源带来毁灭性的危害(陈士林&肖培根，2006；高文远&肖培根，2008)。工业化加上城市化也不断地增加自然资源的压力。由于生态环境的破坏和掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含量下降，甚至耗竭，一些种类濒临灭绝(黄璐琦，2001)。生物技术的蓬勃发展为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。在快速繁殖、保护和增强有用的次级代谢物的水平以满足药物的需求并减少原位采收自然资源方面，植物组织培养技术拥有巨大的潜力(Bapat等，2008)。

黄精叶钩吻属(Croomia)植物是百部科(Stemonaceae)多年生草本植物，花部4基数，属单子叶植物网状脉类群。该属仅6个种，4种(C.heterosepala,C.hyugaensis,C.saitoana和C.kinoshitae)为日本特有(Kato&Ebihara,2011；Kadota,2010，2012)，1种(C.japonica)为中国和日本分布，1种(C.pauciflora)为美国特有。该属植物的总体分布呈古老的东亚-北美间断分布，在亚洲又呈现为中国大陆-日本岛屿的分布格局。该属植物的染色体研究表明该属的3个种(C.heterosepala，C.japonica和C.pauciflora)染色体数目都是2n＝24(Duyfjes,1991；Oginuma等,2001)，但也有研究指出黄精叶钩吻(C.japonica)的染色体数目为2n＝26(李林初，1986)。李恩香(2006)的研究表明该属植物的繁育系统为自交可育的混合交配系统。叶绿体DNA(trnL一F)的研究表明：东亚的两个种是姐妹类群，分歧时间是在更新世中晚期；东亚种与美国种的分歧时间是在上新世晚期到更新世早期(Li等，2008)。方明(2012)基于SSR分子标记和单拷贝核基因Agtl序列研究表明黄精叶钩吻是祖先种，并由它衍生出了日本的C.heterosepala和北美的C.pauciflora。中国的天目山可能是该属植物的分布及起源中心。

黄精叶钩吻属植物是一类种群较小且区域化分布的种，种群的繁殖和散布主要依赖根茎的无性繁殖。由于根茎的活动非常有限，使该属植物成为易受干扰、易濒危的植物(Tomlinson和Ayensu,1968)。因此，该属植物在中国、日本和美国都被列为稀有濒危植物名录(傅立国，1992；Estill&Cruzan,2001；Chafin，2007；Kato&Ebihara,2011)。

黄精叶钩吻，又名金刚大，分布于我国浙江、安徽、江西、福建和日本。该植物的根状茎是民间常用的药物，具有祛风解毒、治跌打损、毒蛇咬伤等功效(浙江植物志，1994)。林文翰等(1993)对金刚大的根部和茎叶的化学成分的研究表明其主要成分为金刚大碱(Croomine)和脱氢金刚大碱((didehydrocroomine)，另外根部还有粉蕊黄杨胺A(pachysamine A)和金刚大啶(Croomionidine)两个甾体生物碱和β-谷甾醇。。

黄精叶钩吻种群间遗传分化高，而种群内的遗传多样性低(li等，2008)，同时由于种群较小、受人类活动影响严重的，因此亟待保护。由于该种植物的结实率较低，因此通过种子发芽的繁殖方式有限，通过根茎的繁殖是其野外繁殖的主要方式，但该方法也很有限。因此，发展和利用离体快繁的方法势在必行。为了保护野生的黄精叶钩吻资源，同时又能满足医药工业的应用，因此有必要建立黄精叶钩吻的离体再生体系，这对丰富植物组织培养的理论和应用生物技术保护种质资源以及满足临床应用等均有重要意义。

迄今为止，国内外关于黄精叶钩吻组织培养方面的研究还是有限的和初步的，仅仅是利用黄精叶钩吻的茎段诱导出愈伤组织和防止愈伤组织褐化的研究(李温平等，2012；陈贝贝等，2012)，未见愈伤组织成功分化出试管苗的报道。

涉及的参考文献具体如下：

1、Bapat V A,Yadav SR,Dixit GB.Rescue of endangered plants through biotechnological applications[J].National Academy Science Letters,2008,31(7&8):201-211(Bapat V A,Yadav SR,Dixit GB.通过生物技术挽救濒危植物[J].国家科学院科学通讯，2008,31(7&8):201-211)；

2、Chafin L G.Field guide to the rare plants of Georgia[M].University of Georgia Press,2007.(Chafin L G.佐治亚州珍稀植物野外指南[M].佐治亚大学出版社，2007.)；

3、Duyfjes B.E.E.Stemonaceae and Pentastemonaceae；with miscellaneous notes on members of both families[J].Blumea,1991,36:239-252.(百部科和鳞百部科：这两个科成员的多种多样的注释[J].Blumea,1991,36:239-252.)；

4、Estill JC，Cruzan MB.Phytogeography of rare plant species endemic to the Southeastern United States[J].Castanea,2001,66(1-2):3-23.(Estill JC，Cruzan MB.美国东南部特有、珍稀植物的植物地理学研究[J].Castanea,2001,66(1-2):3-23.)；

5、Kato M&Ebihara A.Endemic plants of Japan[M].Tokai University Press,2011.(Kato M&Ebihara A.日本的特有植物[M].东海大学出版社,2011.)；

6、Kadota Y.Two new species of Croomia(Stemonaceae)from miyazaki prefecture,kyushu southern Japan[J].The Journal of Japanese Botany,2010,85(5):277-288.(Kadota Y.日本九州南部宫崎县2个黄精叶钩吻属新种[J].日本植物学杂志,2010,85(5):277-288.)；

7、Kadota Y.The new species of Croomia(Stemonaceae)from shikoku,western Japan[J].The Journal of Japanese Botany,2012,87:79-84.(Kadota Y.日本西部—四国,黄精叶钩吻属一个新种[J].日本植物学杂志,2012,87:79-84.)；

8、Li EX,Sun Y,Qiu,YX,et al.Phylogeography of two East Asian species in Croomia(Stemonaceae)inferred from chloroplast DNA and ISSR fingerprinting variation[J].Molecular Phylogenetics and Evolution,2008,49:702-714.(Li EX,Sun Y,Qiu,YX,et al.基于叶绿体DNA和ISSR指纹变异揭示百部科黄精叶钩吻属2个东亚物种的亲缘地理学[J].分子进化与系统发育,2008,49:702-714.)；

9、Oginuma,K.,Horiuchi K,Fukuhara T.Karyomorphology of two genera in Stemonaceae[J].Acta phytotaxonomica et geobotanica,2001,52(1):57-63.(百部科两个属的核型研究[J].植物分类学报,2001,52(1):57-63.)；

10、Tomlinson PB，Ayensu ES.Anatomy of Croomia Pauciflora[J].Journal of the Arnold Arboretum,1968,49:260-277.(Tomlinson PB，Ayensu ES.Croomia Pauciflora的解剖[J].阿诺德植物园杂志,1968,49:260-277.)；

11、陈士林,肖培根.中药资源可持续利用导论[M].北京:中国医药科学出版社,2006；

12、陈贝贝，汪安乐，蒋明等.黄精叶钩吻组培中褐化控制的探讨.浙江农业科学,2012,12(4):490-492；

13、方明.Agt1基于序列及nSSR的黄精叶钩吻属亲缘地理学研究[D].南昌大学硕士学位论文,2012；

14、傅立国.1992.中国植物红皮书一稀有濒危植物[M].北京:科学出版社；

15、高文远,肖培根.生物工程技术与药用植物资源保护[J].中草药,2008,39(7):961-964；

16、国家药典委员会.中华人们共和共药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010；

17、黄璐琦,李慧,陈京荔.珍稀濒危中药资源保护的相关问题探讨[J].世界科学技术—中药现代化,2001,3(6):46-49；

18、李恩香.黄精叶钩吻属的亲缘地理学及其近缘类群的系统进化研究[D].浙江大学博士论文,2006；

19、李林初.一些国产植物的染色体观察[J].广西植物,1986.6(l-2):99-105；

20、李温平,陈贝贝,蒋明等.黄精叶钩吻愈伤组织诱导研究[J].江苏农业科学,2012,40(6):43-44,79；

21、林文翰,蔡孟深,应百平,等.金刚大化学成分的研究[J].药学学报,1993,28(3):202-206；

22、浙江植物志编辑委员会.浙江植物志[M].浙江科学技术出版社,1993,7:373.

文中所提及的缩写字母的以及见如下缩略词表：

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，采用本发明的方法可以短时间内快速培育出大量试管苗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)、取材：

选用黄精叶钩吻的根状茎的不定芽作为外植体；

2)、不定芽的消毒：

将步骤1)所得的根状茎上的不定芽充分洗涤(先用自来水加入微量的洗洁精进行洗涤，接着置于塑料网袋中流水冲洗10～15min)，然后在超净台上操作，先用75％(体积％)酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％(质量％)升汞灭菌8～10min，无菌水冲洗3～5次；

3)、不定芽的启动培养：

将消毒后的不定芽(步骤2)所得)剥离外围的叶片(于超净台中进行)后接种到启动培养基上，进行不定芽生长及丛生芽的诱导；

所述启动培养基为MS+BA0.6～3mg/L+NAA0～0.2mg/L+蔗糖20～30g/l+琼脂5～8g/l，pH为5.6～5.8；

诱导培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

当启动培养基上的不定芽的基部出现至少3个丛生芽(即，不定芽突起)时，结束启动培养(培养时间约2～2.5个月)；

上述启动培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入BA、NAA、蔗糖、琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.6～5.8；每1L的MS基本培养基加入0.6～3mg的BA、0～0.2mg的NAA，20～30g蔗糖，5～8g琼脂；

4)、不定芽的快速扩增：

将步骤3)所得的丛生芽分割成含1新芽(新芽的基部有2～3个突起)的芽丛后转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为MS+BA 0.6～3mg/L+NAA 0.2～0.5mg/L+KT 0～1.0mg/L+2,4-D 0～0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

待增殖培养基上的新芽至少长出3个丛生芽时(约培养35～42天)，结束此步骤的培养；

上述增殖培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入BA、NAA、KT、2,4-D、PVP、蔗糖、琼脂；均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.6～5.8；每1L的MS基本培养基加入0.6～3mg的BA、0.2～0.5mg的NAA、0～1.0mg的KT、0～0.5mg的2,4-D，0.8g的PVP，20～30g蔗糖，5～8g琼脂。

5)、不定芽的伸长及生根培养：

将步骤4)所得的丛生芽切割成含2～3株为一丛的不定芽丛转移到生根/伸长培养基上进行培养(即，从而实现既能伸长生长、同时又能生根)，生根/伸长培养基为MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmoLm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为20±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

当不定芽丛长到4.0～6.0cm高、且基部有至少5条根(5～10条根)时，结束此步骤的培养；

该生根/伸长培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入BA、NAA、PVP，蔗糖、琼脂，均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.6～5.8；每1L的MS基本培养基加入0.6mg的BA、0.5mg的NAA、0.8g的PVP，20～30g蔗糖，5～8g琼脂。

6)、将步骤5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶种植的种苗。

该种苗栽培于河沙：泥炭土为1:1的混合基质上。

作为本发明的黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法的改进：

以步骤4)所得的丛生芽替代步骤3)所得的丛生芽，重复进行步骤4)的不定芽的快速扩增；待增殖培养基上的新芽长出至少3个丛生芽时，将其进行分割。

备注说明：新的丛生芽的数目一般5～9个不等。

作为本发明的黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法的进一步改进：

所述步骤5)为：

将不定芽丛转移到生根/伸长培养基上，经过28～35天的培养，不定芽既能伸长生长，同时在植株的基部产生根，7～14天可诱导形成根，再培养后形成发达的根系。

作为本发明的黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法的进一步改进：

将步骤6)所得的装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，放置1～2天后，将植株基部的生根/伸长培养基(特指该生根/伸长培养基内的琼脂)洗净，将苗移栽到河沙：泥炭土为1：1(重量比)的混合基质培养20～35天，开始的10～14天温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。

作为本发明的黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法的进一步改进：

作为较佳方案：

启动培养基为：MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

增殖培养基为以下任意一种：

MS+BA0.6mg/L+NAA 0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

MS+BA2mg/L+NAA 0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8；

MS+BA2mg/L+KT 1mg/L+NAA 0.2mg/L+2,4-D 0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖20～30g/L+琼脂5～8g/L，pH为5.6～5.8。

在本发明中，照明灯可采用全光谱T5节能灯。

使用本发明的方法，将黄精叶钩吻根状茎的不定芽消毒、接种培养60～75天可诱导形成丛生芽，在此基础上继代培养，丛生芽可大量繁殖，大约每42天继代一次，平均增殖倍数为6.4。把继代后的丛生芽转移到本发明提供的伸长、生根培养基中14～28天可大量发根，生根率在93％左右，再继续培养7-14天可出瓶炼苗。

本发明具有如下技术优势：

1、本发明采用特定的生根/伸长培养基，从而实现将不定芽的伸长生长和生根培养一步完成。

而常规的百部科Stemona属植物的培养，伸长生长和生根分两步完成，生根培养需要单独添加NAA、IAA或IBA等激素。

2、本发明增殖培养基使用的植物激素是低浓度的BA和NAA的组合；能实现不定芽的扩增。

3、本发明步骤3)所需培养时间为2～2.5个月，步骤4)所需的培养时间约为42天，步骤5)所需的培养时间约为42天。

本发明的优点：(1)黄精叶钩吻的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约。2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)该技术方法解决了黄精叶钩吻快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产的目的。(4)使用本发明提供的组培快繁技术得到的黄精叶钩吻幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的黄精叶钩吻，可以提供园林绿化或者提供均一性好的根状茎成品，可以为临床应用提供品质稳定的原材料。(5)可以保存黄精叶钩吻的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。

综上所述，本发明利用黄精叶钩吻的根状茎上的不定芽做为外植体来进行快繁。包括不定芽的消毒，不定芽生长的启动，丛生芽的诱导及快速增殖，丛生芽的伸长及生根培养以及试管苗的移栽。本发明以MS培养基为基础，加入了植物激素：6-苄基腺嘌呤、激动素、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸等，用于黄精叶钩吻不定芽的诱导、增殖及生根等关键阶段的组织培养。本发明成功实现了黄精叶钩吻的组培快繁，可以短时间内快速培育出大量试管苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。

本发明掌握了黄精叶钩吻组织培养中不定芽的启动、丛生芽的增殖和不定芽的伸长、生根等关键阶段的技术，使黄精叶钩吻这一珍稀药用、观赏植物实现快速育苗、工厂化栽培成为可能。使用本发明同时可以有效地保护这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为黄精叶钩吻的组培快繁图；

A、采自天目山的黄精叶钩吻带花的植株；

B、根状茎上的不定芽；

C、不定芽在主成分为MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L的诱导培养上的生长及不定芽周围出现的绿白色的丛生芽；

D、将丛生芽切成2～3个芽的芽丛在主成分为MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L的培养基上的增殖；

E、丛生芽在主成分为MS+BA0.6mg/L+NAA 0.5mg/L培养基上的伸长及生根培养；

F、移栽后生长一个月的组培苗。

具体实施方式

实施例1、一种黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：

1)、取材：

选用黄精叶钩吻的根状茎的不定芽作为外植体；具体为：选用4月份采自天目山的黄精叶钩吻根状茎上的不定芽作为外植体。

2)、不定芽的消毒：

将步骤1)所得的根状茎上的不定芽充分洗涤：先用每1L自来水加入2～3滴洗洁精进行洗涤，接着置于网袋中流水冲洗10～15min；然后将不定芽转移到超净工作台上，先用75％(体积％)酒精浸泡处理20～30sec，无菌水冲洗后，用含0.1％(质量％)升汞(每100mL 0.1％升汞加2～3滴吐温20)灭菌8～10min，无菌水冲洗3～5次后，用于后续步骤的接种。

3)、不定芽的启动培养：

将消毒后的不定芽(步骤2)所得)剥离外围的叶片(于超净台中进行)后接种到启动培养基上，进行不定芽生长及丛生芽的诱导；

所述启动培养基为MS+BA 2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/l+琼脂8g/l，pH为5.6～5.8；

诱导培养条件为：16小时光照，光照强度35μmolm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

当启动培养基上的不定芽的基部出现至少3个的丛生芽(即，不定芽突起)时，结束启动培养(培养时间约为2～2.5个月)；

4)、不定芽的快速扩增：

将步骤3)所得的丛生芽切下分割成含1新芽(新芽的基部有2～3个突起)的芽丛后转接于增殖培养基上进行培养，增殖培养基为MS+BA2mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.6～5.8；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmolm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

待增殖培养基上的新芽长出至少3个丛生芽时，将其用解剖刀分割成相应的至少3个新芽(新芽基部有2-3个突起)。一般而言，35～42天后，每个新芽又可以得到5～9个丛生芽。

备注说明：为了获得更多的丛生芽，可将所得较高较壮的新芽重复进行步骤4)的不定芽的快速扩增；待增殖培养基上的新芽长出至少3个丛生芽时，再进行相应的切割。

6周后，各培养容器内的新芽可再生出5～9个丛生芽。平均增殖倍数约为6.8。

5)、不定芽的伸长及生根培养：

将步骤4)所得的丛生芽切割成含2-3株为一丛的不定芽丛转移到生根/伸长培养基上进行培养(即，从而实现既能伸长生长、同时又能生根)，生根/伸长培养基为MS+BA0.6mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.6～5.8；

培养条件为：16小时光照，光照强度30～45μmoLm^-2s^-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为20±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

当不定芽长到4.0～6.0cm高、且基部有至少5条根(基部突起长至3～5厘米)时，结束此步骤的培养。

一般而言：将不定芽转移到生根/伸长培养基上，经过28～35天的培养，不定芽既能伸长生长，同时又能在植株的基部产生根。即，10～14天不定芽能迅速伸长，7～14天可以看到有根原基形成，21～28天完成生根；35～42天就能实现不定芽长到4.0～6.0cm高、且基部有至少5条根。

6)、将步骤5)所得的已生根的植株取出，得可出瓶种植的种苗，该种苗栽培于河沙：泥炭土为1:1的混合基质上。

具体为：将装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇一层水，放置1～2天后，将植株基部的生根/伸长培养基(特指该生根/伸长培养基内的琼脂)洗净，将苗移栽到河沙：泥炭土为1：1的混合基质培养20～35天，开始的10～14天温度为23～25℃，相对湿度为70～80％。随后即可逐渐过渡到自然的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田，平均存活率达到92％。

实施例2、

将步骤4)中的增殖培养基改为：MS+BA2mg/L+KT1mg/L+NAA0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L+0.8％PVP+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.6～5.8；其余等同于实施例1。

步骤4)中，6周后，各培养容器内的芽丛可再生出5～7个丛生芽；增殖倍数约为5.9。

最终存活率为90％。

实施例3、

将步骤4)中增殖培养基改为MS+BA3mg/L+NAA0.2mg/L+0.8g/L PVP+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH为5.6～5.8；其余等同于实施例1。

步骤4)中，6周后，各培养容器内的芽丛可再生出5～8个丛生芽。增殖倍数约为6.6。

最终存活率为90％。

对比例1-1、

将实施例1步骤4)增殖培养基中的BA的浓度由“2mg/L”改成“4.5mg/L(属于常用浓度)”，其余等同于实施例1。

步骤4)中，6周后，各培养容器内的芽丛可再生出约6～8个丛生芽；增殖倍数约为7.2。

采用此方法，虽然增殖倍数增加，但由于BA浓度太高，植株生长矮化，幼苗产生一定的玻璃化，最终存活率仅为68％。

对比例1-2、

将实施例1步骤4)增殖培养基中“2mg/L的BA”改成“7mg/L的KT”，其余等同于实施例1。

步骤4)中，6周后，各培养容器内的芽丛可再生出约4～6个丛生芽；增殖倍数约为4.7。

该丛生芽细弱，生长不健壮，最终存活率仅为52％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。