粉杂1号粉蕉的组培快繁方法与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及粉杂1号粉蕉的组培快繁方法。

背景技术：

‘粉杂1号’粉蕉，是新选育的抗枯萎病的粉蕉品种，由广东省农业科学院果树研究所、中山市农业局研究出品，为广粉1号粉蕉的偶然实生苗。

目前来说，虽然香蕉组培快繁技术已普遍应用，但粉杂1号粉蕉由于其基因型为四倍体香蕉ABBB类型，用常用的三倍体香蕉（AAA类型）组培快繁方法去培养粉杂1号，其繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低，一般来说可获得的增殖倍数仅为1.3倍，一个吸芽一年才繁殖几百株苗，且小苗假植成活率有时不到20%。如何提高‘粉杂1号’增殖系数而又遗传稳定不变异，极具现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供粉杂1号粉蕉的组培快繁方法。

本发明所采取的技术方案是：

粉杂1号粉蕉的组培快繁方法，包括下列步骤：

1)筛选母株：挑选假茎绿色、粗壮、高度为3.2～4.5m，果穗较大，果指连体果较少，果形正常，品质好的植株为母株；

2)外植体吸芽的处理：对吸芽喷淋多菌灵和链霉素的混合药液，1周后取吸芽为外植体进行接种；

3)分化培养：分化培养温度控制在27℃～33℃，分化培养12～20天进行继代，继代总数控制在12～16代；

4)生根培养和炼苗；用生根培养基接种分化芽，第一周在室内弱光或无光条件下，促根长苗；第二周利用温室炼苗，温度控制在26-30℃，自然光遮荫照射，光照强度控制在4000-5000lux；两周后，光照强度调至8000-10000lux，到出苗为止。

优选的，步骤1）中，新植蕉母株高度为3.2～3.5m，宿根蕉母株高度为3.8～4.5m。如果超过或者低于这个高度，有可能出现与种性不符的劣变现象。

步骤1）中将母株的要求标准化，是为了挑选符合种性、品质优良的植株。如果挑选假茎黄色、瘦弱、果穗较小，果指连体果较多，果形不正常，品质不好的植株为母株，有可能出现与种性不符的劣变现象。

优选的，步骤2）中，当吸芽长至30～50cm高时，对吸芽喷淋50%多菌灵1000倍液和150ppm浓度的链霉素的混合药液，1周后取吸芽为外植体进行接种。

具体使用时，1000公斤的混合药液中含有50%多菌灵1公斤，农用链霉素150克，每芽灌药液0.5公斤。

多菌灵和链霉素的混合药液主要是杀灭吸芽内分生组织的内生细菌。

发明人经过筛选，最终优选出上述两种药以及配比浓度，所获混合药液对细菌效果最好，而且价格相对低廉。

优选的，步骤3）中，分化培养时所用的分化培养基是在MS培养基的基础上添加适量细胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生长素IBA和NAA，控制增殖倍数为2.5～2.8倍。

具体的，分化培养所用的培养基是在MS培养基的基础上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及适量IBA和NAA，在上述范围内调整激素的浓度，控制控制分化芽体的大小及高度，使得增殖率控制在2.5～2.8倍。

增殖倍数控制在2.5-2.8倍下获得的分化芽最佳。如果增值倍数太低，则影响效率和成本；如果增殖倍数太高，芽太多，芽体小，分化芽叶鞘松散泡化，芽体质量差，实际上也影响整个过程的苗的繁殖速度，也有可能发展成为畸形芽。

优选的，步骤3）中，分化培养温度控制在29℃～33℃。

香蕉的组培快繁中分化培养温度一般为25～28℃，本发明优选粉杂1号粉蕉组培快繁中分化培养温度为29℃～33℃，高于以往香蕉的培养温度。培养温度低于29℃时分化芽容易向上生长，增殖率较低；培养温度在33℃以上时，前期分化芽生长较快，后期分化芽叶鞘松散，芽体质量差。在29℃～33℃下培养，分化芽嫩白粗壮，芽体较结实，高度和粗细适中。

优选的，步骤3）中，分化培养15～18天进行继代，继代总数控制在13～15代。

香蕉的组培快繁中一般分化培养20～30天进行继代，而本发明中分化培养天数控制在15～18天进行继代，不超期继代转接，以防止分化芽老化，造成大芽开叶和出根不再分化增殖；继代数13～15代以内。

优选的，步骤3）中继代转接分化芽时，切断截去分化芽部分上部鞘叶，纵切大芽小球茎与叶鞘交界处生长点分生组织而不分离小球茎，去除顶端生长优势，促使侧芽分化丛生。

因为粉蕉低代数分化芽粗大，向上生长势强，容易形成单芽、开叶和出根不再分化。因此利用继代转接分化芽时，切断截去分化芽的部分上部鞘叶，去除顶端生长优势。同时，纵切大芽小球茎与叶鞘交界处生长点分生组织而不分离小球茎，促使侧芽分化丛生。

优选的，步骤4）中生根培养所用的培养基是在MS培养基的基础上添加30g/L蔗糖、0.1～0.2mg/L的IBA和0.5～0.8mg/L的NAA。此配方有利于获得多而小的根系，提高假植成活率。

蔗糖的含量在培养基中为定值，生根时浓度高会难生根，因为渗透压太大。

优选的，步骤4）中，用生根培养基接种分化芽，第一周在室内弱光或无光条件下，促根长苗，温度控制在25℃-28℃；第二周利用温室炼苗，温度控制在26℃-30℃，自然光遮荫照射，光照强度控制在4000-5000lux；2周后，光照强度调至8000-10000lux。即炼苗中后期光线比香蕉苗的要强。

本发明的有益效果是：

本发明组培快繁方法是专门针对‘粉杂1号’粉蕉这个四倍体香蕉品种，区别于现有技术中常用的的三倍体香蕉的组培快繁方法。利用本发明的方法，可以解决‘粉杂1号’粉蕉繁殖速度慢、效率低，生根苗移植成活低而且遗传不稳定，容易变异等的问题。

采用本发明的技术繁殖的粉杂1号生根苗，根系较多，较粗壮且白色，分化增殖倍数为2.5-2.8倍，小苗假茎浅黄绿色，叶片深绿色，假植成活率可高达95%以上，生长较快且整齐，每个外植体一年时间内可繁殖约5000-8000株小苗，定植后种性稳定，很少出现变异株，蕉农反映良好。

本发明将母株的选择范围标准化，目的是为了挑选符合种性、品质优良的植株。利用本发明标准的母株进行组培快繁，才能保证优良的种性。

本发明使用多菌灵和链霉素的混合药液，可以杀灭吸芽内分生组织的内生细菌，效果好，同时价格相对低廉。

本发明的分化培养基是在MS培养基的基础上添加适量细胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生长素IBA和NAA，控制增殖倍数为2.5～2.8倍。增殖倍数控制在2.5～2.8倍下获得的分化芽最佳。如果增值倍数太低，则影响效率和成本；如果增殖倍数太高，芽太多，芽体小，分化芽叶鞘松散泡化，芽体质量差，实际上也影响整个过程的苗的繁殖速度，也有可能发展成为畸形芽。

本发明优选粉杂1号粉蕉组培快繁中分化培养温度为29℃～33℃，高于普通的香蕉组培快繁分化培养的温度。当培养温度低于29℃时分化芽容易向上生长，增殖率较低，培养温度在33℃以上时，前期分化芽生长较快，后期分化芽叶鞘松散，芽体质量差。在29℃～33℃下培养，分化芽嫩白粗壮，芽体较结实，高度和粗细适中。

本发明分化培养天数控制在15～18天进行继代，不超期继代转接，以防止分化芽老化，造成大芽开叶和出根不再分化增殖；继代数13～15代以内。

本发明还公开了继代转接分切技术，去除顶端生长优势，促使侧芽分化丛生。

本发明的生根培养基适当降低了IBA浓度，增加了NAA浓度，有利于根系多而小些，提高假植成活率。

本发明炼苗培养中后期光线比香蕉苗的要强，有利于促进苗的假茎生长为黄绿色，叶片绿色，生命力强。

附图说明

图1为粉杂1号组培增殖培养；

图2为粉杂1号大棚假植杯苗。

具体实施方式

中英文缩略词：

6-BA为6-苄基腺呤，TDZ为N-苄苯基-N'-1,2,3-噻二唑-5-脲，KT-30为N-（2-氯-4-吡啶基）-N-苯基脲，IBA为吲哚丁酸，NAA为奈乙酸。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

实施地点：广东省农业科学院果树研究所母本园，时间：2012年10月-11月。

（1）母株的筛选：选择假茎绿色、粗壮、高度为3.2～3.5m，果穗较大，果指连体果较少，果形正常，品质好的新植蕉植株，种于大棚或隔离种植园中，作为母本园，供取芽之用。

（2）外植体吸芽的处理：当吸芽长至30-50cm时，对吸芽喷淋50%多菌灵1000倍液和150ppm农用链霉素的混合药液。具体的，1000公斤的混合药液中含有50%多菌灵1公斤，农用链霉素150克，每芽灌混合药液0.5公斤；1周后取吸芽为外植体进行接种。

（3）分化培养：分化培养利用玻璃瓶或聚丙烯薄膜袋为包装容器，温度控制在29℃～33℃。

粉蕉组培增殖倍数与温度有极大相关性。控制分化芽增殖培养温度在31±2℃。培养温度低于29℃时分化芽容易向上生长，增殖率较低，培养温度在33℃以上时，前期分化芽生长较快，后期分化芽叶鞘松散，芽体质量差。

分化培养15-18天进行继代。粉蕉低代数分化芽粗大，向上生长势强，容易形成单芽、开叶和出根不再分化。继代转接分化芽时，切断截去分化芽的部分上部鞘叶，纵切大芽小球茎与叶鞘交界处生长点分生组织而不分离小球茎，以去除顶端生长优势，促使侧芽分化丛生。继代总数控制在13～15代。

分化培养所用的培养基，包括下列组分：在常规香牙蕉（AAA类型）培养基的基础上添加适量细胞分裂素6-BA、TDZ和KT-30以及生长素IBA和NAA，调整上述激素的浓度，控制分化芽体的大小及高度，使得增殖倍数控制在2.5-2.8倍，所获分化芽生长结实质优。

（4）生根培养和炼苗：所用生根培养基在香蕉生根培养基的基础上适当降低IBA浓度，增加NAA浓度，促进生长的根系多而小，提高假植成活率。具体的，生根培养基包括下列组分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.1mg/L+NAA0.6mg/L。生根培养用聚丙烯薄膜袋为包装容器，每袋接种8株大小一致的较粗壮分化芽。

用生根培养基接种分化芽，第一周在室内弱光或无光条件下，促根长苗；第二周利用温室炼苗，温度控制在26-30℃，自然光遮荫照射，光照强度控制在4000-5000lux；两周后，光照强度调至8000-10000lux，其他条件同第二周。四周后组培苗茎干充实叶片浓绿（见图1），移植成活率较高，可达95%以上。

采用本技术，本单位每年快繁粉杂1号粉蕉40-80万株苗，种植后深受蕉农好评。

实施例2

实施地点：广东省农业科学院果树研究所母本园，时间：2013年10月开始。

（1）母株的筛选：选择假茎绿色、粗壮、高度为3.4m的新植蕉和4.1m的宿根蕉，果穗较大，果指连体果较少，果形正常，品质好的植株，作为母本树，供取芽之用。

（2）外植体吸芽的处理：当吸芽长至30-50cm时，对吸芽喷淋50%多菌灵1000倍液加150ppm农用链霉素的混合药液，每芽灌混合药液0.5公斤；1周后取吸芽为外植体进行接种。

（3）分化培养：分化培养利用聚丙烯薄膜袋为包装容器，温度控制在29℃～33℃。分化培养15天进行继代，继代转接分化芽时，切断截去分化芽的部分上部鞘叶，纵切大芽小球茎与叶鞘交界处生长点分生组织而不分离小球茎，以去除顶端生长优势，促使侧芽分化丛生。继代总数控制在15代。

分化培养所用的培养基，包括下列组分：在MS培养基的基础上添加细胞分裂素3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30以及适量生长素IBA和NAA，调整上述激素的浓度（主要调整细胞分裂素的浓度），控制分化芽体的大小及高度，使得增殖率控制在2.6倍。

（4）生根培养：所用生根培养基包括下列组分：MS+蔗糖30g/L+IBA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L。生根培养用聚丙烯薄膜袋为包装容器，每袋接种8株大小一致的较粗壮分化芽。

用生根培养基接种分化芽后在室内弱光或无光条件下促根假茎拉高培养，温度控制在25℃-28℃；第二周开始在温室炼苗，自然光遮荫照射，光照强度控制在4000-5000lux；2周后光照强度调至8000-10000lux，到出苗为止。4周后组培苗茎干充实叶片浓绿，移植成活率达96%以上。

所得到的粉杂1号生根苗，根系较多，较粗壮且白色，小苗假茎浅黄绿色，叶片深绿色，假植成杯苗（图2）的成活率高，达到95%以上，生长较快且整齐，每个外植体（吸芽）一年可继代培养13-15代，总共可繁殖约5000-8000株小苗，定植后种性稳定，很少出现变异株，蕉农反映良好。

实施例3

实施地点：广东省农业科学院果树研究所母本园，时间：2014年10月开始。

（1）母株的筛选：选择假茎绿色、粗壮、高度为4.0m，果穗较大，果指连体果较少，果形正常的宿根蕉植株，作为母本树，供取芽之用。

（2）外植体吸芽的处理：当吸芽长至40cm时，对吸芽喷淋50%多菌灵1000倍液加150ppm农用链霉素的混合药液，每芽灌混合药液0.5公斤；1周后取吸芽为外植体进行接种。

（3）分化培养：分化培养利用玻璃瓶为包装容器，温度控制在29℃～33℃。分化培养17天进行继代，继代转接分化芽时，切断截去分化芽的部分上部鞘叶，纵切大芽小球茎与叶鞘交界处生长点分生组织而不分离小球茎，以去除顶端生长优势，促使侧芽分化丛生。继代总数控制在13代。

分化培养所用的培养基是在MS培养基的基础上添加 3～5mg/L得6-BA、0.004～0.015mg/L的TDZ 、0.3～0.6mg/L的KT-30 ，以及适量IBA和NAA，在上述范围内调整激素的浓度，控制控制分化芽体的大小及高度，使得增殖率控制在2.8倍。

（4）生根培养和炼苗：所用生根培养基包括下列组分：MS+蔗糖30g/L+IBA0.2mg/L+NAA0.7mg/L。生根培养用聚丙烯薄膜袋为包装容器，每袋接种8株大小一致的较粗壮分化芽。

在室内弱光或无光促根长促苗，温度控制在25℃-28℃；一周后利用温室炼苗，温度控制在26℃-30℃，自然光遮蔽下培养一周，光照强度控制在4000-5000lux；两周后，光照强度调至8000-10000lux。4周后组培苗茎干充实叶片浓绿，移植成活率较高。

用这种技术繁殖的粉杂1号生根苗，根系较多，较粗壮且白色，小苗假茎浅黄绿色，叶片深绿色，假植成活率高，达到96%，生长较快且整齐，每个外植体一年时间内可繁殖约6000～7000株小苗，共繁殖了近80万株，定植后种性稳定，产量高，果形好，变异株约1%，蕉农反映良好。

对比例1

其他方法同实施例1，不同之处在于：

利用香牙蕉如巴西蕉的分化培养基MS+6-BA 3～4mg/L+IBA0.2mg/L替代本发明的分化培养基，进行粉杂1号粉蕉的培养，结果是分化芽增殖率低，芽体向上直长，长时间培养粉杂1号粉蕉组培苗仅长根长叶而不分化。

对比例2

其他方法同实施例1，不同之处在于：

利用香蕉生根培养基配方MS+蔗糖20g/L+IBA1mg/L+NAA0.2mg/L替代本发明的生根培养基来进行粉杂1号粉蕉的促根，结果是根少而粗，小苗假植成活率较低，有时仅达20%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。