本发明涉及一种种子萌发及育苗的方法领域，更具体地说，本发明涉及一种快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法。
背景技术：
马尾松是我国南方最重要的荒山绿化造林树种之一，在我国分布范围极为广阔。其经济价值高，用途广，是工农业生产上的重要用材，不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。木材极耐水湿，有“水中千年松”之说，特别适用于水下工程。马尾松研究从上世纪80年代开始，经过几十年的发展，选育了大量的优良无性系，并通过建立马尾松初级种子园，生产了大量马尾松良种。但是完成建园时间要2～4年时间，林地管理要2年时间，成本高。而通过嫁接苗的方法直接上山种植，一定程度能降低成本，但成活率低，达50％以上，给建园带来很大困难。
马尾松的无性繁殖难度较大，其中组织培养更加困难。但由于植物的组织培养具有繁殖系数大、苗木生长整齐等优点，攻克其组织培养技术意义重大。传统的无菌培养多采用琼脂粉(条)培养基，需要经过琼脂粉(条)加热溶解、杀菌和冷却凝结三个步骤，操作较为繁琐；另外，无菌培养由于存在种子发芽率和污染等多种问题，无菌苗的成苗率在20％以下，使80％以上的培养基成为废弃物难以回收再利用而造成浪费。
马尾松是组织培养生根较为困难的树种。以初代培养的马尾松丛生芽生根生根率较为理想，但经继代培养后，其生根率明显下降。吴小芹等(2009)和季孔庶等(2010)将经过丛芽诱导和伸长的初代培养后单芽直接进行生根，其生根率分别为85％和92.5％；而薛鹰(2006)在经过继代培养以后取单芽生根，其生根率仅为26.7％。要实现马尾松组培苗工厂化生产，必须突破继代芽生根困难瓶颈因素。
如何快速、低成本、高成活率地获得马尾松造林育苗是当前亟待解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种操作简便、成本低廉和成活率高的快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，为其荒山绿化造林提供良好的技术基础。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种快速获取马尾松无繁性殖造林育苗的方法，包括以下步骤：
1)种子萌发
A、制作棉花培养基
将棉花用清水洗净，拧干后放置于溶液a中浸泡30min，其中所述溶液a由1L水中加入7g魔芋粉和25g蔗糖混合而成，然后将浸泡好的棉花放入培养瓶中，并将培养瓶置于冰箱中冰冻30min；再将无纺布洗净，并浸泡于水中，10min后将无纺布覆盖在培养瓶中棉花的上表面，拧紧瓶盖，放入灭菌锅内灭菌，灭菌条件为115℃，30min，备用，其中，所述无纺布上设置有彼此均匀间隔的孔径为1cm的圆孔，相邻两个圆孔间距为0.4cm；
B、消毒处理
首先将马尾松种子置于质量分数为0.4％的硫酸铜溶液中，超声波处理；然后依次用质量分数为75％酒精淋洗1min，质量分数为0.05％HgCl2溶液淋洗10min；最后用质量分数为3％NaClO溶液浸泡20min，并用清水冲洗干净，备用；
在培养室中将消毒处理好的马尾松种子接种到棉花培养基中，每个无纺布的圆孔接种1粒种子，进行种子萌发，得到马尾松无菌芽Z；
2)切下长度为4～6cm的马尾松无菌芽Z的顶芽，作为外植体，置于培养基b中进行培养，得到马尾松丛生芽；其中所述培养基b由每1LMS培养基中加入3mg 6-BA、0.2mg NAA、50g马铃薯和20g蔗糖混合而成；
3)切下伸长至4～6cm长的马尾松丛生芽的顶芽或者嫩茎，种植于培养基c中进行伸长培养后，得伸长芽；切下长度4～6cm的伸长芽的顶芽或者嫩茎接种到培养基d中进行增殖，获得继代芽；
其中所述培养基c由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、0.5mg NAA、3000mg蔗糖和7000mg琼脂混合而成；所述培养基d由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、1mg 2，4-D、1mg 6-BA、1mg KT、0.3mg NAA、3g蔗糖和7g琼脂混合而成；
4)切下生长健壮、高3～4cm的继代芽，用液体培养基e浸泡25～35min，取出后用液体培养基f浸泡15～25min，移植于育苗器中，荧光照射处理，获得马尾松无性繁殖苗；
其中所述液体培养基e由每1LDCR培养基中加入75mgIBA和30mgNAA混合而成；液体培养基f由每1LGD培养基中加入0.4mgABT6和5g滑石粉混合而成；
其中所述荧光照射具体为：①将荧光粉装入透明塑料袋中，装满整个塑料袋，并封口；其中塑料袋为长5～10cm，宽2～4cm的长方形结构；②将塑料袋黏贴在育苗器外侧，塑料袋下边缘与育苗器内生根基质上表面边缘齐平；
5)移栽苗圃：将生长良好的马尾松无性繁殖苗移栽到苗圃。
优选的是，所述快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，步骤(1)中所述溶液a的配置方法：首先将蔗糖与水先溶解均匀，再加入魔芋粉，待魔芋粉吸水膨胀完全。
优选的是，所述快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，步骤(1)中所述棉花平铺在培养瓶的瓶底，厚度为1.8～3.0cm。
优选的是，所述快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，步骤(1)中所述超声波处理的方法为：先用频率为40KHz超声波处理20min，静置10min，再用频率为80KHz超声波处理20min，静置10min，最后用频率为40KHz超声波处理20min。
优选的是，所述快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，步骤(3)中所述培养基c和培养基d中的荧光粉是在其它原料混合均匀后，最后加入荧光粉。
优选的是，所述快速获取马尾松无性繁殖造林育苗的方法，步骤(4)中所述育苗器中装有固体培养基，所述固体培养基包括河沙、蛭石、苔藓和红土以5:2:1:2的比例混合均匀后装填于育苗器中；在所述育苗器的培养基中淋入100g质量分数为2％的Ca(H2PO4)2溶液和100g质量分数为1％的尿素溶液。
本发明至少包括以下有益效果：
第一，针对目前无菌苗培养采用琼脂作为培养基存在的问题，本发明采用具有良好吸水和保水性能的棉花，辅于具有强吸水性，吸水后体积可膨胀80～100倍的魔芋粉，利用用冰箱冰冻技术和无纺布对其外形进行固定，消毒后的马尾松种子放入棉花培养基中培养即可获得生长健壮的无菌苗，无菌苗成苗率在30～45％，同时可简化实验步骤，提高培养效率，且棉花和无纺布可重复利用，可降低成本又保护环境。
第二，将种子放入0.4％的硫酸铜溶液中，利用超声波使硫酸铜溶液内部振动，促进其硫酸铜溶液的杀菌作用，同是可解除种子的休眠，促进了种子的萌发，8～18d可获得生长健壮的无菌苗。
第三，利用马铃薯自身营养物质优势与6-BA和NAA联合作用促进诱导愈伤组织和丛生芽的形成。
第四，利用荧光粉可吸收储存光能，并在黑暗条件下缓慢释放弱光的性能，配合2，4-D、6-BA、KT和NAA的联合作用，使继代芽的伸长更加均衡，丛生芽继代培养5代，平均增殖系数7.2。
第五、利用IBA、NAA、ABT6和滑石粉，促进继代芽不定根的表达和伸长，根系多而粗壮，利用荧光粉可吸收储存光能，并在黑暗条件下缓慢释放弱光的性能，促进马尾松无性繁殖育苗的生长，生根率达95％以上。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
1)种子萌发
A、制作棉花培养基
将棉花用清水洗净，拧干后放置于溶液a中浸泡30min，然后将浸泡好的棉花铺在培养瓶的瓶底，厚度为1.8cm，并将培养瓶置于冰箱中冰冻30min；再将无纺布洗净，并浸泡于水中，10min后将无纺布覆盖在培养瓶中棉花的上表面，拧紧瓶盖，放入灭菌锅内灭菌，灭菌条件为115℃，30min，备用；
其中，所述无纺布上设置有彼此均匀间隔的孔径为1cm的圆孔，相邻两个圆孔间距为0.4cm；
其中所述溶液a的配置方法：溶液a由1L水中加入7g魔芋粉和25g蔗糖混合而成，首先将蔗糖与水先溶解均匀，再加入魔芋粉，待魔芋粉吸水膨胀完全；
B、消毒处理
首先将马尾松种子置于质量分数为0.4％的硫酸铜溶液中，超声波处理；然后依次用质量分数为75％酒精淋洗1min，质量分数为0.05％HgCl2溶液淋洗10min；最后用质量分数为3％NaClO溶液浸泡20min，并用清水冲洗干净，备用；
其中所述超声波处理的方法为：先用频率为40KHz超声波处理20min，静置10min，再用频率为80KHz超声波处理20min，静置10min，最后用频率为40KHz超声波处理20min；
在培养室中将消毒处理好的马尾松种子接种到棉花培养基中，每个无纺布的圆孔接种1粒种子，进行种子萌发，培养18d后，得到马尾松无菌芽Z，萌发成苗率为40％；
2)切下长度为4cm的马尾松无菌芽Z的顶芽，作为外植体，置于培养基b中进行培养，培养25d后，得到马尾松丛生芽；其中所述培养基b由每1LMS培养基中加入3mg 6-BA、0.2mg NAA、50g马铃薯和20g蔗糖混合而成；
3)切下伸长至5cm长的马尾松丛生芽的顶芽或者嫩茎，种植于培养基c中进行伸长培养后，培养24d后得伸长芽；切下长度5cm的伸长芽的顶芽或者嫩茎接种到培养基d中进行增殖，培养24d后获得继代芽，继代培养繁殖5代，平均增殖系数为7.0；
其中所述培养基c由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、0.5mg NAA、3000mg蔗糖和7000mg琼脂混合而成；所述培养基d由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、1mg 2，4-D、1mg 6-BA、1mg KT、0.3mg NAA、3g蔗糖和7g琼脂混合而成；荧光粉是在其它原料混合均匀后，最后加入；
4)切下生长健壮、高3cm的继代芽，用液体培养基e浸泡25min，取出后用液体培养基f浸泡15min，移植于育苗器中，荧光照射处理，培养24d后，获得马尾松无性繁殖苗，生根率为96％；
其中所述液体培养基e由每1LDCR培养基中加入75mgIBA和30mgNAA混合而成；液体培养基f由每1LGD培养基中加入0.4mgABT6和5g滑石粉混合而成；
其中育苗器中装有固体培养基，所述固体培养基包括河沙、蛭石、苔藓和红土以5:2:1:2的比例混合均匀后装填于育苗器中；再在育苗器的培养基中淋入100g质量分数为2％的Ca(H2PO4)2溶液和100g质量分数为1％的尿素溶液。
其中所述荧光照射具体为：①将荧光粉装入透明塑料袋中，装满整个塑料袋，并封口；其中塑料袋为长5cm，宽2cm的长方形结构；②将塑料袋黏贴在育苗器外侧，塑料袋下边缘与育苗器内生根基质上表面边缘齐平；
5)移栽苗圃：将生长良好的马尾松无性繁殖苗移栽到苗圃。
实施例2：
1)种子萌发
A、制作棉花培养基
将棉花用清水洗净，拧干后放置于溶液a中浸泡30min，然后将浸泡好的棉花铺在培养瓶的瓶底，厚度为3cm，并将培养瓶置于冰箱中冰冻30min；再将无纺布洗净，并浸泡于水中，10min后将无纺布覆盖在培养瓶中棉花的上表面，拧紧瓶盖，放入灭菌锅内灭菌，灭菌条件为115℃，30min，备用；
其中，所述无纺布上设置有彼此均匀间隔的孔径为1cm的圆孔，相邻两个圆孔间距为0.4cm；
其中所述溶液a的配置方法：溶液a由1L水中加入7g魔芋粉和25g蔗糖混合而成，首先将蔗糖与水先溶解均匀，再加入魔芋粉，待魔芋粉吸水膨胀完全；
B、消毒处理
首先将马尾松种子置于质量分数为0.4％的硫酸铜溶液中，超声波处理；然后依次用质量分数为75％酒精淋洗1min，质量分数为0.05％HgCl2溶液淋洗10min；最后用质量分数为3％NaClO溶液浸泡20min，并用清水冲洗干净，备用；
其中所述超声波处理的方法为：先用频率为40KHz超声波处理20min，静置10min，再用频率为80KHz超声波处理20min，静置10min，最后用频率为40KHz超声波处理20min；
在培养室中将消毒处理好的马尾松种子接种到棉花培养基中，每个无纺布的圆孔接种1粒种子，进行种子萌发，培养8d后，得到马尾松无菌芽Z，萌发成苗率为45％；
2)切下长度为5cm的马尾松无菌芽Z的顶芽，作为外植体，置于培养基b中进行培养，培养23d后，得到马尾松丛生芽；其中所述培养基b由每1LMS培养基中加入3mg 6-BA、0.2mg NAA、50g马铃薯和20g蔗糖混合而成；
3)切下伸长至4cm长的马尾松丛生芽的顶芽或者嫩茎，种植于培养基c中进行伸长培养后，培养23d后得伸长芽；切下长度4cm的伸长芽的顶芽或者嫩茎接种到培养基d中进行增殖，培养22d后获得继代芽，继代培养繁殖5代，平均增殖系数为7.5；
其中所述培养基c由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、0.5mg NAA、3000mg蔗糖和7000mg琼脂混合而成；所述培养基d由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、1mg 2，4-D、1mg 6-BA、1mg KT、0.3mg NAA、3g蔗糖和7g琼脂混合而成；荧光粉是在其它原料混合均匀后，最后加入；
4)切下生长健壮、高4cm的继代芽，用液体培养基e浸泡35min，取出后用液体培养基f浸泡20min，移植于育苗器中，荧光照射处理，培养22d后，获得马尾松无性繁殖苗，生根率为98％；
其中所述液体培养基e由每1LDCR培养基中加入75mgIBA和30mgNAA混合而成；液体培养基f由每1LGD培养基中加入0.4mgABT6和5g滑石粉混合而成；
其中育苗器中装有固体培养基，所述固体培养基包括河沙、蛭石、苔藓和红土以5:2:1:2的比例混合均匀后装填于育苗器中；再在育苗器的培养基中淋入100g质量分数为2％的Ca(H2PO4)2溶液和100g质量分数为1％的尿素溶液。
其中所述荧光照射具体为：①将荧光粉装入透明塑料袋中，装满整个塑料袋，并封口；其中塑料袋为长6cm，宽3cm的长方形结构；②将塑料袋黏贴在育苗器外侧，塑料袋下边缘与育苗器内生根基质上表面边缘齐平；
5)移栽苗圃：将生长良好的马尾松无性繁殖苗移栽到苗圃。
实施例3：
1)种子萌发
A、制作棉花培养基
将棉花用清水洗净，拧干后放置于溶液a中浸泡30min，然后将浸泡好的棉花铺在培养瓶的瓶底，厚度为3cm，并将培养瓶置于冰箱中冰冻30min；再将无纺布洗净，并浸泡于水中，10min后将无纺布覆盖在培养瓶中棉花的上表面，拧紧瓶盖，放入灭菌锅内灭菌，灭菌条件为115℃，30min，备用；
其中，所述无纺布上设置有彼此均匀间隔的孔径为1cm的圆孔，相邻两个圆孔间距为0.4cm；
其中所述溶液a的配置方法：溶液a由1L水中加入7g魔芋粉和25g蔗糖混合而成，首先将蔗糖与水先溶解均匀，再加入魔芋粉，待魔芋粉吸水膨胀完全；
B、消毒处理
首先将马尾松种子置于质量分数为0.4％的硫酸铜溶液中，超声波处理；然后依次用质量分数为75％酒精淋洗1min，质量分数为0.05％HgCl2溶液淋洗10min；最后用质量分数为3％NaClO溶液浸泡20min，并用清水冲洗干净，备用；
其中所述超声波处理的方法为：先用频率为40KHz超声波处理20min，静置10min，再用频率为80KHz超声波处理20min，静置10min，最后用频率为40KHz超声波处理20min；
在培养室中将消毒处理好的马尾松种子接种到棉花培养基中，每个无纺布的圆孔接种1粒种子，进行种子萌发，培养15d后，得到马尾松无菌芽Z萌发成苗率为30％；
2)切下长度为6cm的马尾松无菌芽Z的顶芽，作为外植体，置于培养基b中进行培养，培养20d后，得到马尾松丛生芽；其中所述培养基b由每1LMS培养基中加入3mg 6-BA、0.2mg NAA、50g马铃薯和20g蔗糖混合而成；
3)切下伸长至6cm长的马尾松丛生芽的顶芽或者嫩茎，种植于培养基c中进行伸长培养后，培养22d后得伸长芽；切下长度6cm的伸长芽的顶芽或者嫩茎接种到培养基d中进行增殖，培养20d后获得继代芽，直至得到继代芽5，继代培养繁殖5代，平均增殖系数为7.2；
其中所述培养基c由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、0.5mg NAA、3000mg蔗糖和7000mg琼脂混合而成；所述培养基d由每1LMS培养基中加入20mg荧光粉、1mg 2，4-D、1mg 6-BA、1mg KT、0.3mg NAA、3g蔗糖和7g琼脂混合而成；荧光粉是在其它原料混合均匀后，最后加入；
4)切下生长健壮、高3.5cm的继代芽，用液体培养基e浸泡25min，取出后用液体培养基f浸泡25min，移植于育苗器中，荧光照射处理，培养28d后，获得马尾松无性繁殖苗，生根率为95％；
其中所述液体培养基e由每1LDCR培养基中加入75mgIBA和30mgNAA混合而成；液体培养基f由每1LGD培养基中加入0.4mgABT6和5g滑石粉混合而成；
其中育苗器中装有固体培养基，所述固体培养基包括河沙、蛭石、苔藓和红土以5:2:1:2的比例混合均匀后装填于育苗器中；再在育苗器的培养基中淋入100g质量分数为2％的Ca(H2PO4)2溶液和100g质量分数为1％的尿素溶液。
其中所述荧光照射具体为：①将荧光粉装入透明塑料袋中，装满整个塑料袋，并封口；其中塑料袋为长10cm，宽4cm的长方形结构；②将塑料袋黏贴在育苗器外侧，塑料袋下边缘与育苗器内生根基质上表面边缘齐平；
5)移栽苗圃：将生长良好的马尾松无性繁殖苗移栽到苗圃。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。