一种利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法与流程

本发明涉及一种利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，属于植物品种培育技术领域。

背景技术：

桑(学名：Morus alba L.)：桑科桑属，落叶乔木或灌木，高可达15米。树体富含乳浆，树皮黄褐色。叶卵形至广卵形，叶端尖，叶基圆形或浅心脏形，边缘有粗锯齿，有时有不规则的分裂。叶面无毛，有光泽，叶背脉上有疏毛。雌雄异株，5月开花，葇荑花序。果熟期6～7月，聚花果卵圆形或圆柱形，黑紫色或白色。喜光，幼时稍耐阴。喜温暖湿润气候，耐寒。耐干旱，耐水湿能力极强。原产中国中部和北部。中国东北至西南各省区，西北直至新疆均有栽培。朝鲜、日本、蒙古、中亚各国、俄罗斯、欧洲等地以及印度、越南亦均有栽培。叶为桑蚕饲料。木材可制器具，枝条可编箩筐，桑皮可作造纸原料，桑椹可供食用、酿酒，叶、果和根皮可入药。

选育桑树品种的方法中，以化学诱变法的突变率高，选育周期短等优势，成为选育桑树品种的主要手段。中国专利文献CN105123511A(申请号201510562489.6)公开了一种化学诱变选育桑树多倍体的方法，用0.4％秋水仙碱(colchicine)加3％二甲亚砜(DMSO)混合液作为诱变剂，对2年以上的生长旺盛、生长点饱满、无病虫害的成龄桑树新梢进行化学诱变处理，通过世代选择而获得遗传稳定的具有优良或是特殊生物学性状和经济性状的桑树新品系。本方法能够获得较高频率的多倍体突变植株，且变异谱较广，可获得遗传稳定的优良桑树新品系，有利于桑树品种的改良；同时可以根据蚕桑生产实际需求定向选择亲本，进而获得在生物学性状和经济性状更为优良的新品种，以适应多元化和全年多次养蚕生产对桑品种的要求，提高了蚕桑业的经济效益。

但上述方法存在正向突变率低、致死率高等缺陷，从而导致筛选率低的问题。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法。

本发明技术方案如下：

一种利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，步骤如下：

(1)扦插苗苗高50cm以上，幼龄桑、成龄桑春伐或夏伐后长出的新梢，选取枝条健壮、顶芽饱满、无病虫害的顶芽，采用诱变剂处理顶芽，2～5天后重复处理一次，获得诱变材料；

所述的诱变剂为含有质量浓度为0.3～0.5％秋水仙碱和1.5～2.5mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)的乙醇溶液；

(2)将步骤(1)获得的诱变材料培养15～20天后，选取变异条，经染色体鉴定，确定染色体变异的材料，然后进行诱导枝的繁育，经性状正突变筛选和遗传稳定筛选后，获得新品种，嫁接扩繁建立良种接穗园。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的新梢为开五叶后的新梢。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的诱变剂处理为将诱变剂注入顶芽的空隙，注射量为0.8～1.2ml。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中采用诱变剂处理顶芽，3天后重复处理一次。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中诱变剂为含有质量浓度为0.4％秋水仙碱和2mg/L 6-苄基嘌呤的乙醇溶液。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，染色体鉴定采用去壁低渗法。去壁低渗法为植物染色体鉴定常规技术，可参见《蚕学通讯》1996年第一期，出版号ISSN:1006-0561，作者余茂德。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，性状正突变筛选标准如下：

①叶片，形状及叶脉不紊乱、叶面积增加15％以上、厚度大于200μm；

②枝条上皮孔数为10～15个/cm²，皮孔大小为2～6mm；

③节间距小于4cm；

④诱导后枝条长至50cm以上时，枝条固定成稳定的叶序；

⑤枝条较未诱导枝直径长1～3mm。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，诱导枝的繁育为通过无性繁殖方式进行。无性繁殖方式如嫁接、扦插等，可以继承和保持亲本性状，不产生分离，再通过试验鉴定比较分析等方法，确定其遗传是否稳定。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，遗传稳定筛选采用AMMI模型稳定性分析方法。AMMI模型稳定性分析方法为本领域常规技术，可参见《蚕业科学》2008年第一期，出版号:ISSN0257-4799，CN32-1115/S，作者孙日彦。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，嫁接扩繁步骤如下：

春季诱导成的变异枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取诱导枝的中上部，用袋接法进行嫁接；第二年桑树夏伐前，取变异枝生长芽，采用管状芽接法嫁接。

上述“T”形芽接法、袋接法、管状芽接法均为本领域常规技术，“T”形芽接法可参见《中国桑树栽培学》(中国农业科学院蚕业研究所主编：1985，出版号16119·447)、袋接法可参见《实用桑树栽培学》(吴仁儒主编：1989，出版号ISBN7-5364-1453-6/S·224)、管状芽接法可参见《桑树栽培与育种学》(柯益富主编：1997，出版号ISBN7-109-04315-0/S·2673)。

有益效果

本发明首次采用秋水仙碱和6-苄基嘌呤作为诱变剂处理特殊时期的桑树顶芽，较现有常规诱变方法，显著提高了正突变率，降低了诱变致死率，可以显著提高新品种的培育速度和几率。

附图说明

图1为本发明实施例中诱导桑品种“选792”获得的新品种“鲁诱3号”；

图2为本发明所述诱导后枝条长至20cm左右时叶序紊乱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

一种利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，步骤如下：

(1)扦插苗苗高50cm以上，幼龄桑、成龄桑春伐或夏伐后长出的开五叶后的新梢，选取枝条健壮、顶芽饱满、无病虫害的顶芽，将诱变剂注满顶芽(用4号针头进行注射，量以注满顶芽不溢出为准，注射量为1ml)，3天后重复处理一次，获得诱变材料；

所述的诱变剂为含有质量浓度为0.4％秋水仙碱和2mg/L 6-苄基嘌呤(6-BA)的乙醇溶液；

(2)将步骤(1)获得的诱变材料培养15～20天后，选取变异条，经染色体鉴定，确定染色体变异的材料，然后进行诱导枝的繁育，经性状正突变筛选和遗传稳定筛选后，获得新品种，进行嫁接扩繁建立良种接穗园。

所述步骤(2)中，性状正突变筛选标准如下：

①叶片，形状及叶脉不紊乱、叶面积增加15％以上、厚度大于200μm；

②枝条上皮孔数为10～15个/cm²，皮孔大小为2～6mm；

③节间距小于4cm；

④诱导后枝条长至50cm以上时，枝条固定成稳定的叶序；

⑤枝条较未诱导枝直径长1～3mm。

所述步骤(2)中，诱导枝的繁育为通过扦插的繁殖方式进行。

所述步骤(2)中，遗传稳定筛选采用AMMI模型稳定性分析方法。

所述步骤(2)中，嫁接扩繁步骤如下：

春季诱导成的变异枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取诱导枝的中上部，用袋接法进行嫁接；第二年桑树夏伐前，取变异枝生长芽，采用管状芽接法嫁接。

所述步骤(2)中，染色体鉴定采用去壁低渗法，去壁低渗法为植物染色体鉴定常规技术，可参见《蚕学通讯》1996年第一期，出版号ISSN:1006-0561，作者余茂德；具体步骤如下：

(i)取待鉴定桑树的幼叶、顶芽、叶原基或腋芽原基部分，置于饱和对二氯苯溶液中，处理2～4h，制得预处理样品；

(ii)将步骤(i)制得的预处理样品水洗后，置于固定液中，在5～10℃条件下固定4～24h，制得固定后样品；

所述固定液由冰醋酸与乙醇按体积比1：3的比例混合；

(iii)将步骤(ii)制得的固定后样品经体积百分比浓度为85％的酒精浸渍10min，体积百分比浓度为70％的酒精浸渍10min，体积百分比浓度为50％的酒精浸渍10min，体积百分比浓度为35％的酒精浸渍10min，水洗后，转入1N盐酸中，在60℃条件下，恒温处理10min，制得解离样品；

(iv)将步骤(iii)制得的解离样品水洗后，移至载玻片上，用改良苯酚品红染色液染色5min后，经压片，观察确定染色体数目。

所述步骤(2)中，嫁接扩繁步骤如下：

春季诱导成的变异枝，在夏秋季采用“T”形芽接法嫁接；第二年春，取诱导枝的中上部，用袋接法进行嫁接；第二年桑树夏伐前，取变异枝生长芽，采用管状芽接法嫁接。

实施例2

如实施例1所述的利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，不同之处在于，

诱变剂分别为质量浓度0.4％秋水仙碱和浓度为1.5、2、2.5mg/L 6-苄基嘌呤三个配比的乙醇溶液，对桑品种选792成龄桑诱导，当年变异率、致死率、正突变率实验结果如表1所示：

表1

实施例3

如实施例1所述的利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，不同之处在于，

对成龄桑、幼龄桑、扦插苗进行处理，应用spss19软件进行配对样本T检验变异率、致死率、正突变率，结果如表2所示，结果表明三处理类型不存在显著差异，即本诱导剂对成龄桑、幼龄桑、扦插苗进行处理，效果差异不显著。

表2

注：成龄桑品种为选792，幼龄桑及扦插苗为鲁插1号。

对比例1

如实施例1所述的利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，不同之处在于，

秋水仙碱乙醇溶液(下同)质量浓度配比分别为0.3％、0.4％、0.5％，对桑品种选792成龄桑诱导，使用注射法进行，3天后重复注射，当年变异率、致死率、正突变率结果如表3所示：

表3

对比例2

如实施例1所述的利用秋水仙碱诱变选育桑树品种的方法，不同之处在于，

诱变剂含有质量浓度0.4％秋水仙碱和质量浓度分别为1％、2％、3％的二甲亚砜的混合液，分别用上述诱变剂对桑品种选792成龄桑诱导，当年变异率、致死率、正突变率实验结果如表4所示：

表4

结果分析

由以上结果可以看出，以0.4％浓度的秋水仙碱配比，正突变率最高(如表3所示)；由表1可知，以0.4％秋水仙碱和2mg/L 6-苄基嘌呤乙醇溶液作为诱变剂效果最好。由表4可知，以0.4％秋水仙碱和2％二甲亚砜混合液表现最好。通过表1和表4对比可以看出，0.4％秋水仙碱和2mg/L 6-苄基嘌呤乙醇溶液作诱导剂可显著提高枝条存活率及正突变率。