一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明属植物繁殖技术领域，涉及组织培养育苗技术，尤其是一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法。
【背景技术】
[0002]马尾舱iPinus原产我国，是我国南方重要的荒山绿化、造纸原料林和采脂林、自然风景林的重要树种之一，在我国分布范围极为广阔。作为一种综合利用价值高、推广潜力大的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺和石油等不可再生资源逐渐枯竭等矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，马尾松作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种之一，大力发展马尾松人工林很有必要。
[0003]我国自“六五”国家科技攻关以来，在马尾松良种选育和速生丰产栽培技术等方面取得了较大突破。目前，马尾松良种主要以种子园和母树林的有性繁殖为主。然而，有性繁殖存在着遗传分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而无性繁殖却能克服有性繁殖的上述不足。
[0004]体胚发生及器官发生是目前全世界最为常用的两种无性组培技术途径。其中，体胚发生技术含量高，繁殖速度快，其主要是以未成熟合子胚为外植体，通过系列的体胚培养技术培育无性体胚苗，该技术能在较短时间内获得大量苗木，但由于体胚苗根系发育较弱，且其生长对氮含量要求较高，因此对环境的适应能力较差，成活率不高。器官发生技术较易掌握，在生产上较为常用，其中“以芽繁芽”组培快繁方式尤为常见，该技术培育苗木根系发达，芽苗健壮，环境适应性强，但由于其繁殖倍数较低，继代周期长，生产成本偏高。
[0005]马尾松属组织培养困难的树种。国内众多学者对马尾松体胚发生及器官发生技术进行了大量的研究，其中马尾松体胚发生技术主要集中在体胚诱导、增殖与成熟培养方面研究，就体胚萌发及转化方面的明显成效仍鲜少见，其原因主要在于体胚苗萌发及转化率不高，根系质量差，得苗率偏低，技术应用性不强。而通过器官发生途径的马尾松组培快繁技术，由于继代芽增殖系数偏低，培育周期长，严重制约了马尾松组培苗的快速繁育。
【发明内容】
[0006]本发明的目的主要针对马尾松体胚苗萌发率低、根系质量差，通过器官发生途径的马尾松组培繁殖效率低、继代培养周期长等现状，为解决马尾松良种匮乏，实现马尾松优良群体无性化组培苗广泛推广应用，提供一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法。
[0007]本发明是这样实现的：
一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法，包括体胚萌发、体胚苗伸长、增殖培养、丛芽伸长和生根培养的工序，将发育成熟的马尾松体细胞胚置于萌发培养基，萌发成芽苗后转入伸长培养基进行培养，待芽苗伸长后，切掉根系转入增殖培养基进行丛芽诱导，将诱导丛芽转入伸长培养基进行伸长，待芽苗达3-5 cm高时，将芽苗单个切下置于生根培养基中进行生根处理，获得马尾松优良群体组培生根苗，其操作步骤如下:
(1)体胚萌发:将白色不透明，具有蜡质光泽，并发育成子叶期的成熟马尾松体细胞胚置于萌发培养基中进行萌发；
(2)体胚苗伸长:待萌发体胚苗叶片转绿，下胚轴基部变红，根茎叶分化后，转至伸长培养基中进行伸长培养；
(3)增殖培养:体胚苗伸长至3-5cm高时，将体胚苗切去根系后直接放入增殖培养基中进行丛芽诱导；
(4)丛芽伸长:将诱导出的丛芽转入伸长培养基进行伸长培养；
(5)生根培养:单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的马尾松芽苗，接种在生根培养基中，进行生根培养，获得马尾松优良群体组培生根苗。
[0008]以上所述的萌发培养基其原料含量为:活性炭10 g.L \葡萄糖20 g.L \乳糖5g.L \蔗糖5 g.L 1和1/2改良MS培养基。
[0009]以上所述的伸长培养基其原料含量为:活性炭5 g.L \蔗糖30 g.L 1和改良MS
培养基。
[0010]以上所述的增殖培养基其原料含量为:6-BA 0-1.0 mg.L \噻苯隆(TDZ)1.0-3.0 mg.L \ Meta-Topolin (MT) 1.0-2.0 mg.L \蔗糖 30 g.L 1 和改良 MS 培养基。
[0011]以上所述的生根培养基其原料含量为:ABT6 1.0-2.0 mg.L \ IAA 0.5-1.0mg.L \椰子汁10 mL.L \活性炭1.0-2.5 g.L \蔗糖10 g.L 1和1/2改良MS培养基。
[0012]以上所述的改良MS培养基的基本组成为=KNO3 1050 mg *L SNH4NO3 850 mg *L SCaCl2.2Η20 260 mg.L ^MgSO 4.7H20 370 mg.L SCa (NO 3) 2.4H20 600 mg.L SKH2PO4 340mg *L SMnSO 4.H2O 22.3 mg *L SZnSO 4.7Η20 8.6 mg.L SCuSO 4.5Η20 0.025 mg *L 3B036.2 mg.L SNa 2Mo04.2H20 0.025 mg.L SKI 0.83 mg.L SCoCl 2.6H20 0.025 mg.L S维生素B1 1.0 mg.L S维生素B6 0.5 mg.L S烟酸0.5 mg.L S甘氨酸2.0 mg.L S肌醇 100 mg.L 1 ο
[0013]以上步骤(I)所述的体胚萌发的培育控制条件为:暗培养、无光照，培养温度20±1°C;步骤(2)所述的体胚苗伸长、步骤(3)所述的增殖培养、步骤(4)所述的丛芽伸长、步骤(5)所述的生根培养的培育控制条件均为:光培养，光照1500-2000 lx，每日光照16h，培养温度20-28 °C。
[0014]本发明相对于现有的技术具有以下优点:
1、本发明创建了体胚发生与器官发生相融合的一种高效培育马尾松优良群体无性化组培苗的繁育技术，能迅速、高效地获取大量优质马尾松优良群体组培苗，有效解决了体胚发生中体胚苗根系较弱、生长差以及器官发生中芽苗增殖率低、繁殖周期长等问题，具有显著的创新性和进步性。
[0015]2、通过本发明技术，马尾松体胚苗萌发率高达97%以上，通过器官发生途径的生根培养，生根率达95%，且根系发达，芽苗健壮、活力旺盛，成活率高，苗木培育周期明显缩短，效果显著，解决马尾松良种匮乏的问题，实现马尾松优良群体无性化组培苗广泛推广应用，具有较好的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0016]图1为活力旺盛的马尾松胚性细胞系。
[0017]图2为马尾松胚性细胞系经成熟培养后形成的体细胞胚。
[0018]图3为经体胚萌发后产生的马尾松体胚苗。
[0019]图4为经生根培养后形成的马尾松组培生根苗。
【具体实施方式】
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0021]实施例1:
一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法，以马尾松优良家系未成熟子叶前期合子胚为外植体，通过体胚发生获取了大量活力旺盛马尾松胚性细胞系。其中，将胚性细胞系SE-3经成熟培养后产生的白色不透明，具有蜡质光泽，且发育成子叶期的成熟体细胞胚置于萌发培养基进行萌发；所述的萌发培养基为:1/2改良MS培养基+活性炭10 g.L k葡萄糖20 g.L 4乳糖5 g.L 4蔗糖5 g-L'o培育控制条件为:暗培养、无光照，培养温度20±1°C。培养I周，萌发率达97.4%。
[0022]待萌发体胚苗叶片转绿，下胚轴基部变红，根茎叶分化后，转至伸长培养基中进行体胚苗伸长培养；所述的伸长培养基为:改良MS培养基+活性炭5 g *L k蔗糖30 g-L'o培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0023]伸长培养40天后，体胚苗伸长至3-5 cm高时，将体胚苗切去根系后直接放入增殖培养基中进行丛芽诱导增殖培养；所述的增殖培养基为:改良MS培养基+噻苯隆(TDZ)2.0mg.L 1+Meta-Topolin (MT) 1.5 mg.L '+蔗糖30 g.L、培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0024]增殖培养30天，将诱导出的丛芽转入上述所述的伸长培养基中进行丛芽伸长培养。培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0025]伸长培养45天，单个切下生长健壮、半木质化、高2-3cm的芽苗，接种在生根培养基中，进行生根培养；所述的生根培养基为1/2改良MS培养基+ABT6 1.0 mg.L '+IAA 1.0mg.L '+椰子汁10 mL.L '+活性炭1.0 g.L k蔗糖10 g.L ^培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。生根培养28天，生根率达93%。
[0026]以上所述的改良MS培养基的基本组成为=KNO3 1050 mg *L SNH4NO3 850 mg *L SCaCl2.2Η20 260 mg.L ^MgSO 4.7H20 370 mg.L SCa (NO 3) 2.4H20 600 mg.L SKH2PO4 340mg *L SMnSO 4.H2O 22.3 mg *L SZnSO 4.7Η20 8.6 mg.L SCuSO 4.5Η20 0.025 mg *L 3B036.2 mg.L SNa 2Mo04.2H20 0.025 mg.L SKI 0.83 mg.L SCoCl 2.6H20 0.025 mg.L S维生素B1 1.0 mg.L S维生素B6 0.5 mg.L S烟酸0.5 mg.L S甘氨酸2.0 mg.L S肌醇 100 mg.L 1 ο
[0027]实施例2:
一种繁育马尾松优良群体无性化组培苗的方法，以马尾松优良家系未成熟子叶前期合子胚为外植体，通过体胚发生获取了大量活力旺盛马尾松胚性细胞系。其中，将胚性细胞系SE-3经成熟培养后产生的白色不透明，具有蜡质光泽，且发育成子叶期的成熟体细胞胚置于萌发培养基进行萌发；所述的萌发培养基为:1/2改良MS培养基+活性炭10 g.L k葡萄糖20 g.L k乳糖5 g.L 4蔗糖5 g-L'o培育控制条件为:暗培养、无光照，培养温度20±1°C。培养2周，萌发率达98.1%。
[0028]待萌发体胚苗叶片转绿，下胚轴基部变红，根茎叶分化后，转至伸长培养基中进行体胚苗伸长培养；所述的伸长培养基为:改良MS培养基+活性炭5 g *L k蔗糖30 g-L'o培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0029]伸长培养40天体胚苗伸长至3-5 cm高时，将体胚苗切去根系后直接放入增殖培养基中进行丛芽诱导增殖培养；所述的增殖培养基为:改良MS培养基+6-BA 0.5 mg - L噻苯隆(TDZ) 1.5 mg.L ^Meta-Topolin (MT) 2.0 mg.L k 鹿糖 30 g.L1。培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0030]增殖培养25天，将诱导出的丛芽转入上述所述的伸长培养基中进行丛芽伸长培养。培育控制条件均为:光培养，光照1500 lx，每日光照16 h，培养温度20-28°C。
[0031]伸长培养45天，单个切下生长健壮、半木质化、高2-3c