一种利用橡胶草叶片再生植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种利用橡胶草叶片再生植株的方法。
【背景技术】
[0002]橡胶草(Taraxacumkok-saghyz Rodin)又名俄罗斯蒲公英(Russian dandel1n)，为菊科蒲公英属的一种多年生草本植物，原产于哈萨克斯坦、欧洲以及中国新疆等地。橡胶草根部含有高品质的橡胶，含量可达20 %以上(多年生的干重)，在工业上的利用价值不次于巴西橡胶树橡胶，而且橡胶草具有生长周期短、适应性强、适合机械化种植和采收等优点，使其成为具有发展前途的巴西橡胶树橡胶替代作物。除了橡胶之外，橡胶草的根、叶中还可以提取菊糖，提胶后的残渣可以加工酒精、沼气，并且具有一定药用价值。在原材料、能源日趋紧张的今天，橡胶草作为科研材料、工业原料和生物能源等方面均具有较大的优势。但橡胶草自交不亲和，自花授粉结实率很低，杂种率高，通过种子繁殖不利于优良品种的保存和繁殖，而且种子繁殖周期长，繁殖效率低，难以满足产业化的要求。尤其对于野外采集的珍稀材料，种子采集受季节的限制很大，叶片和根相对比较容易获得，因此，高效、成熟的橡胶草组织培养技术为珍稀材料的保存与繁殖以及推动橡胶草产业化具有十分重要的意义。
[0003]以橡胶草叶片作为外植体，诱导不定芽或者愈伤组织的研究已有报道[林伯煌，魏小弟[J].热带农业工程，2009，33(4):1-3;罗成华，闫洁，祝建波[J].北方园艺，2012 (07):115-119 ;陈菲，曲彦婷，李黎，等[J]国土与自然资源研究，2014，1:93-94 ;Uteulin K, Mukhambetzhanov S, Rakhimbaev I[J].Internat1nal Journal of B1logica
I,Veterinary, Agricultural and Food Engineering, 2014，8 (4): 373-375]。但由于橡胶草具有自交不亲和的繁殖特点，造成其品系混杂比较严重，不同品系之间的组织培养条件和方法存在差异，现有方法中关于橡胶草叶片诱导愈伤组织及其再生植株的方法不系统，诱导效率不高，诱导效果不够理想。
【发明内容】
[0004](一 )要解决的技术问题
[0005]针对现有技术中橡胶草的叶片诱导愈伤组织及再生植株的方法诱导效果不理想的缺陷，本发明提供一种利用橡胶草叶片再生植株的方法。
[0006]( 二)技术方案
[0007]本发明所述的方法，包括如下步骤:
[0008]I)将预处理后的橡胶草叶片接种到愈伤诱导培养基中进行培养，至诱导出愈伤组织，所述愈伤诱导培养基的组成包括:MS+1.8?2.2mg/L 6-BA+0.4?0.6mg/L NAA或IAA ；
[0009]2)将所述愈伤组织转移到继代培养基中进行培养，得到大量生长状况良好的愈伤组织，所述继代培养基的物质组成包括:MS+1.3?1.7mg/L 6-BA+0.1?0.3mg/L NAA或IAA ；
[0010]3)将所述生长状况良好的愈伤组织接种到不定芽培养基上进行培养，至长出不定芽，所述不定芽培养基的物质组成包括:MS+0.8?1.2mg/L 6-BA ;
[0011]4)将所述不定芽转接至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基的组成包括:1/2MS+0.3 ?0.5mg/L NAA 或 IAA ；
[0012]5)将生根后的苗在室温下炼苗后，移至培养基质中培养，得到橡胶草再生植株。本发明中，通过对各培养基中激素种类的选择，进一步对激素浓度进行调整，得到了适于橡胶草叶片再生植株的培养基。
[0013]所述愈伤诱导培养中和继代培养中的培养条件为:培养温度为23±2°C，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时。
[0014]所述不定芽诱导过程和生根过程中的培养条件为:培养温度为23±2°C，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时。
[0015]对所述橡胶草的叶片进行表面清洗和消毒的步骤为:取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70%酒精中，表面消毒I?2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15%的双氧水中表面消毒6?8min，最后用无菌水冲洗5_6遍，然后将表面的水吸干。
[0016]所述步骤5)中，具体操作为:根长至8-lOcm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3?5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的混合培养基质中，并在80%?95%的空气湿度和25±2°C的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。
[0017]所述愈伤诱导培养基中还包括蔗糖25?35g/L，琼脂6?8g/L ;所述继代培养基中还包括蔗糖25?30g/L，琼脂6?7g/L ;所述不定芽诱导培养基中还包括蔗糖15?25g/L，琼脂5?7g/L ;所述生根培养基中还包括蔗糖10?20g/L，琼脂5?7g/L ;所述培养基的pH均为6.0?7.0。
[0018]本发明所述的愈伤组织的诱导和植株的培养方法，优选包括如下步骤:
[0019]I)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70%酒精中，表面消毒I?2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15 %的双氧水中表面消毒6?8min，然后用无菌水冲洗5-6遍，将叶片表面的水吸干，得备用材料；
[0020]2)将所述备用材料接种到愈伤诱导培养基中，至诱导出愈伤组织；所述愈伤诱导培养过程中，培养温度为23±2°C，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤诱导培养基为:MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA,并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0 ；
[0021]3)将所述愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2°C，光照强度为2000-2500LUX，每天光照12小时；所述的愈伤组织继代培养基为:MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA,并添加蔗糖 30g/L，琼脂 7g/L，pH 调整至 6.0-7.0 ；
[0022]4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2°C，光照强度为2500-3000LUX，每天光照16小时；所述的不定芽诱导培养基为:MS+1.0mg/L 6-BA,并添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0 ;
[0023]5)不定芽长至3_5cm时，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23 ± 2 °C，光照光强为2500-3000LUX，每天光照16小时；所述的生根培养基为:1/2MS+0.4mg/L IAA,并添加蔗糖 15g/L，琼脂 7g/L，pH 调整至 6.0-7.0 ；
[0024]6)根长至8-lOcm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3?5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的体积比为4:1的混合培养基质中，并在80%?95%的空气湿度和25±2°C的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。
[0025](三)有益效果
[0026]上述利用橡胶草叶片再生植株的方法，繁殖系数高，没有褐化和白化苗发生，再生植株生长健壮，根系发达，移植成活率尚，可在短时间内获得大量的再生植株。
[0027]本发明为橡胶草大规模无性繁殖提供一种效率高、周期较短、繁殖系数高的方法，为橡胶草分子育种奠定基础。
【附图说明】
[0028]图1是转接至愈伤诱导培养基的叶片外植体；
[0029]图2是诱导分化的愈伤组织；
[0030]图3是由愈伤组织诱导分化的不定芽；
[0031]图4是不定芽诱导生根的情况；
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用