本发明属于植物繁殖技术领域，涉及一种赤皮青冈嫩枝组培繁殖方法。
背景技术：
赤皮青冈(Cyclobalanopsis gilva (Blume) Oerst),属壳斗科青冈属(Cyclobalanopsis Oerst)植物，为常绿乔木，高达30米，树皮暗褐色，耐贫瘠，在我国广泛分布于浙江、湖南等省。赤皮青冈心材呈深红褐色，边材呈黄褐色，纹理直，质坚重，强韧有弹性，气干密度0.85-0.91克/立方厘米，用途广泛，经济价值很高，是我国珍贵的硬材树种之一。由于大量砍伐，已沦为濒危树种。一方面，赤皮青冈种子属于顽拗性种子，其萌发时间很长，发芽率较低，且容易遭虫害，不易保存，存活率很低，有性繁殖速度慢；另一方面,有性繁殖不能保证林木的优良特性，然而，组织培养能通过无性繁殖，遗传树种的优良特性，能在短时间内快速繁殖获得大量优质的组培苗，为优质种源推广提供可能。
技术实现要素：
本发明的目的是针对赤皮青冈组织培养过程中芽增殖系数低，生长缓慢等问题,提供一种生长效果好、扩繁快的赤皮青冈嫩枝组培繁殖方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种赤皮青冈嫩枝组培繁殖方法，包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集半木质化、生长健壮的当年生赤皮青冈嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，具体操作步骤如下：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生赤皮青冈嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10-15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间15-20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，培养30-35 d，初始芽萌发、生长；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，培养35-40 d，形成壮芽；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L。
以上所述的增殖培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述的壮芽培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L。
以上所述的生根培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培养基的组分和体积重量比为：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，盐酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上步骤（3）所述的初始芽诱导培养的培育控制条件为：光培养、光照500-1000 lx，培养温度20±1℃；步骤（4）所述的增殖培养、步骤（5）所述的壮芽培养、步骤（6）所述的生根培养的培育控制条件均为：光培养，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
1、本发明以赤皮青冈当年生嫩枝作为外植体，经过初始芽培养基培养，初始芽萌动率90%以上；经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，芽增殖系数5/30d-7/30d，再将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，从而缩短了赤皮青冈的育苗周期，节省育苗材料，克服了传统育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
2、本发明将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，余下小芽丛继续增殖培养，使得材料能够多次继代，实现大量增殖，规模化生产壮芽，实现黄樟油素型樟树的扩繁。
3、本发明对WPM基本培养基进行了改良，同时重点调整了与赤皮青冈出芽壮芽相关元素，使得培养基更科学，更有针对性，更易促使赤皮青冈芽诱导的发生、增殖和壮芽，效果显著。
4、本发明操作过程简便，培养周期短，继代芽产量大,并且质量优，增殖系数达到5以上的组培苗产业化技术要求，具有很好的经济效益、生态效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生赤皮青冈嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间15 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照500 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为94%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培养基的组分和体积重量比为：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，盐酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
实施例2：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生赤皮青冈嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为92%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培养基的组分和体积重量比为：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，盐酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
实施例3：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生赤皮青冈嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+蔗糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良WPM培养基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为95%；；所述的生根培养基的配方为：1/2改良WPM培养基+6-BA 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述改良WPM培养基的组分和体积重量比为：NH4NO3 370mg/L，CaCl2·2H2O 82 mg/L，MgSO4·7H20 270 mg/L，KH2PO4 170 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，Na2·EDTA 37.4 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，盐酸硫胺素1.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。