本发明属于植物组织培养技术领域，尤其是涉及一种青冈树获取无菌外植体制备及初始芽的方法。
背景技术：
青冈树(Cyclobalanopsis glauca(Thunb.) Oerst. ),属壳斗科栎属植物，为落叶或常绿乔木，五月开黄绿色花，花单性，雌雄同株，雄花柔荑花序，细长下垂。坚果卵形或椭圆形，生于杯状壳斗中，十月成熟。叶子会随天气的变化而变化，所以还称为“气象树”。为亚热带树种，是我国分布最广的树种之一。朝鲜、日本、印度也有分布。中性喜光，幼龄稍耐侧方庇荫。喜生于微碱性或中性的石灰岩土壤上，在酸性土壤上也生长良好。深根性直根系，耐干燥，可生长于多石砾的山地。萌芽力强，可采用萌芽更新。木材质地坚硬耐腐，一般用来做铁道枕木，也用来制造家具和器皿等。组织培养能通过无性繁殖，遗传树种的优良特性，能在短时间内快速繁殖获得大量优质的组培苗，为优质种源推广提供可能。青冈树组织培养困难主要是因为外植体消毒困难，还有在初始芽诱导培养过程中，易褐化、初始芽发生率低、芽苗不伸长、活性差等瓶颈问题，严重限制了青冈树优良无性系的推广与应用。
技术实现要素：
本发明针对现有青冈树组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提供一种青冈树无菌外植体制备及初始芽诱导的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下
一种青冈树获取无菌外植体制备及初始芽的方法，包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集青冈树当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20-30天后，获得生长快、活力旺盛的青冈树初始芽，其操作步骤如下：
（1）外植体准备：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集青冈树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；
（2）外植体消毒处理：
将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20-30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1-2 min，再移入体积浓度为5-8 %的升汞溶液中浸泡10-20 min，取出放于体积浓度为10-25 %的双氧水和2-5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30 min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5-2.0 mg·L-1 + MT 1.0-3.0 mg·L-1 + NAA 1.0-3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的青冈树初始芽。初始芽萌动率在90%以上。
以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 2200mg·L-1；NH4NO3 780 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 180 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
优选的，以上适宜条件为：温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx。
对比于现有技术，本发明的优点及积极效果如下：
1、本发明选取当年青冈树生嫩枝为组培繁殖材料，外植体的萌芽条幼态化程度高，极大地提高了外植体的有效性，从而成功建立一种青冈树茎段组培方法，本方法对加快青冈树优质壮苗的生产，促进国家硬木用材快速发展，调整林业品种结构具有重大意义。
2、本发明依次采用一定的浓度及消毒时间的广谱杀菌剂、酒精、升汞、双氧水和吐温相配合的消毒处理的方式，无菌外植体获取率高，达到90%以上。
3、本发明使用优化诱导培养基及培养方式，外植体褐化少，初始芽发生率高，芽苗伸长快、活力旺盛，具有较好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集青冈树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1 %的广谱杀菌剂中浸泡30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1 min，再移入体积浓度为5 %的升汞溶液中浸泡20 min，取出放于体积浓度为10 %的双氧水和2滴吐温的混合液中搅拌浸泡30 min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-2.0cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）0.5 mg·L-1 + MT 1.0 mg·L-1 + NAA 1.0mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-35天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的青冈树初始芽，初始芽萌动率92%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 2200mg·L-1；NH4NO3 780 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 180 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
实施例2：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集青冈树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.2 %的广谱杀菌剂中浸泡25 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为6 %的升汞溶液中浸泡15 min，取出放于体积浓度为15 %的双氧水和4滴吐温的混合液中搅拌浸泡25 min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，2.0-2.5 cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）1.5 mg·L-1 + MT 2.0 mg·L-1 + NAA 2.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.1-0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-25天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的青冈树初始芽，初始芽萌动率95%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 2200mg·L-1；NH4NO3 780 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 180 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。
实施例3：
在至少连续3天晴朗的气候里，采集青冈树的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡2 min，再移入体积浓度为8 %的升汞溶液中浸泡10 min，取出放于体积浓度为25 %的双氧水和5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20 min后，最后用无菌水洗4次，每次冲洗3 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，2.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + 噻苯隆（TDZ）2.0 mg·L-1 + MT 3.0 mg·L-1 + NAA 3.0 mg·L-1 + 葡萄糖30 g·L-1 + 琼脂3.5 g·L-1 + 0.3 %广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：25-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16 h，光照强度为：≤1000 lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的青冈树初始芽，初始芽萌动率94%。
所述的改良MS培养基的组成为：KNO3 2200mg·L-1；NH4NO3 780 mg·L-1；CaCl2·2H2O 230 mg·L-1；MgSO4·7H2O 180 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 400 mg·L-1；KH2PO4 170 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.5 mg·L-1；维生素B6 0.6 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 200 mg·L-1。