本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种海风藤离体快速繁殖方法。
背景技术：
海风藤别名满坑香、老藤、大风藤、岩胡椒，为双子叶植物药胡椒科植物细叶青蒌藤的藤茎，性味归经为辛、苦，微温。海风藤始载于《开宝本草》，又名风藤，具有祛风湿，通经络，理气，治风寒湿痹、关节疼痛、筋脉拘挛、跌打损伤、哮喘、久咳等功效。
海风藤是我国常用大宗中药材，还是沙县小吃传统药膳调味秘方的重要成分。据统计，分布全国各地的沙县小吃店对海风藤干品每年消耗量在100吨以上。然而，随着小吃业快速发展，对海风藤的需求量越来越大，其价格也水涨船高。野生海风藤资源经频繁采挖，日渐稀少，已远不能满足市场需要，人工栽培是解决其问题的主要途径，而大规模优质种苗成为人工栽培的瓶颈。因此建立和完善海风藤繁育体系，是保护和持续利用野生种质资源的主要措施之一。目前，国内外对海风藤人工繁殖的研究较少。
三明市农业科学研究院对海风藤试管苗的快速繁殖方法进行研究，通过组织培养，可使原先主要依赖野生采摘和扦插繁殖的海风藤种苗产量大幅提升。该方法可提高海风藤增殖系数和瓶苗质量，是一种试管苗高效快繁方法，可满足海风藤的规模化种植要求。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是一种繁殖率高、试管苗品质优良，能大规模繁育海风藤种苗的海风藤离体快速繁殖方法，应用该方法能满足海风藤人工栽培的规模化种植需求，以解决野生海风藤资源日渐稀少而市场上供不应求的现状。
本发明所采用的技术方案是：一种海风藤离体快速繁殖方法，具体步骤如下：
①外植体的预处理、选取和消毒
选择长势旺盛的健康海风藤，喷施30％代森锰锌悬浮液800倍液，每周喷施一次，连续3次；然后剪取海风藤新长出的前5节藤茎，将其藤茎剪成3～5cm的带芽茎，用洗洁精水溶液清洗干净，晾干备用；在超净工作台上用72％乙醇溶液浸泡30～35秒，再用无菌水冲洗2～3次，用无菌滤纸吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2节嫩茎消毒7～9min，后3节藤茎消毒10～12min，再用无菌水清洗3～4遍，然后用无菌滤纸吸干后备用；
②海风藤腋芽诱导培养
将步骤①处理后的外植体转接到腋芽诱导培养基上，进行诱导培养30～40天，诱导出高为3～5cm的腋芽；所述腋芽诱导培养基的配方为：1/2MS+5.5g/L琼脂+20g/L白糖，PH值为5.8；
③海风藤不定芽的增殖培养
将步骤②诱导培养后的腋芽转接到不定芽增殖培养基上，进行增殖培养30～40天，再将腋芽分切成一节节带芽部分并将其转接到不定芽增殖培养基上，如此循环操作，可获得大量海风藤不定芽；所述不定芽增殖培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
④海风藤不定芽的增殖壮苗培养
将步骤③增殖培养后的不定芽转接到增殖壮苗培养基上，进行壮苗培养30～40天，使植株长高长壮并产生若干丛生苗；所述增殖壮苗培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
⑤海风藤不定芽的生根培养
将经步骤④壮苗培养后的丛生苗转接到生根培养基上，进行生根培养30～40天，使幼苗基部长出3条以上根系，即可进行海风藤组培苗的驯化和移栽；所述生根培养基的配方为：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L琼脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值为5.8。
所述步骤②、③、④、⑤中的培养条件为：培养温度为25±2℃，散光光照时间为12小时/天，光照强度为2000lx。
步骤①中所述剪取海风藤新长出的前5节藤茎为可常年剪取。所述30％代森锰锌悬浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均为质量百分含量。
所述MS即MS培养基。
所述1/2MS即1/2MS培养基，是指将MS配方中大量元素减半，其它不变而配置的培养基。
所述6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，所述KT即激动素。
本发明的有益效果是:1、本发明通过采用离体快速繁殖，增殖系数和种苗质量高，可用于大规模繁育海风藤优质种苗，能满足海风藤的规模化生产要求和市场需要，且有利于保护野生海风藤资源和生态环境；2、本发明通过采用科学配方的腋芽诱导培养基、不定芽增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基，不定芽体的增殖率每个培养周期可达3.5倍以上，生根率达100％，种苗健壮；3、本发明通过采用对海风藤外植体进行喷施30％代森锰锌悬浮液800倍液的预处理，在诱导培养阶段采用散光培养，有效地降低诱导的消毒污染率，消毒成功率可达80％以上；4、本发明通过采用在不定芽增殖壮苗培养基中添加多效唑，有效的诱导出健壮的丛生苗，大大的提升海风藤试管苗的品质。
具体实施方式
下面结具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
一种海风藤离体快速繁殖方法，具体步骤如下：
①外植体的预处理、选取和消毒
选择长势旺盛的健康海风藤，喷施30％代森锰锌悬浮液800倍液，每周喷施一次，连续3次；然后剪取海风藤新长出的前5节藤茎，将其藤茎剪成3～5cm的带芽茎，用洗洁精水溶液清洗干净，晾干备用；在超净工作台上用72％乙醇溶液浸泡30秒，再用无菌水冲洗2次，用无菌滤纸吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2节嫩茎消毒7min，后3节藤茎消毒10min，再用无菌水清洗3遍，然后用无菌滤纸吸干后备用；
②海风藤腋芽诱导培养
将步骤①处理后的外植体转接到腋芽诱导培养基上，进行诱导培养30天，诱导出高为3～5cm的腋芽；所述腋芽诱导培养基的配方为：1/2MS+5.5g/L琼脂+20g/L白糖，PH值为5.8；
③海风藤不定芽的增殖培养
将步骤②诱导培养后的腋芽转接到不定芽增殖培养基上，进行增殖培养30天，再将腋芽分切成一节节带芽部分并将其转接到不定芽增殖培养基上，如此循环操作，可获得大量海风藤不定芽；所述不定芽增殖培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
④海风藤不定芽的增殖壮苗培养
将步骤③增殖培养后的不定芽转接到增殖壮苗培养基上，进行壮苗培养30天，使植株长高长壮并产生若干丛生苗；所述增殖壮苗培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
⑤海风藤不定芽的生根培养
将经步骤④壮苗培养后的丛生苗转接到生根培养基上，进行生根培养30天，使幼苗基部长出3条以上根系，即可进行海风藤组培苗的驯化和移栽；所述生根培养基的配方为：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L琼脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值为5.8。
所述步骤②、③、④、⑤中的培养条件为：培养温度为25±2℃，散光光照时间为12小时/天，光照强度为2000lx。
步骤①中所述剪取海风藤新长出的前5节藤茎为可常年剪取。所述30％代森锰锌悬浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均为质量百分含量。
所述MS即MS培养基。
所述1/2MS即1/2MS培养基，是指将MS配方中大量元素减半，其它不变而配置的培养基。
所述6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，所述KT即激动素。
实施例2
一种海风藤离体快速繁殖方法，具体步骤如下：
①外植体的预处理、选取和消毒
选择长势旺盛的健康海风藤，喷施30％代森锰锌悬浮液800倍液，每周喷施一次，连续3次；然后剪取海风藤新长出的前5节藤茎，将其藤茎剪成3～5cm的带芽茎，用洗洁精水溶液清洗干净，晾干备用；在超净工作台上用72％乙醇溶液浸泡35秒，再用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2节嫩茎消毒9min，后3节藤茎消毒12min，再用无菌水清洗4遍，然后用无菌滤纸吸干后备用；
②海风藤腋芽诱导培养
将步骤①处理后的外植体转接到腋芽诱导培养基上，进行诱导培养40天，诱导出高为3～5cm的腋芽；所述腋芽诱导培养基的配方为：1/2MS+5.5g/L琼脂+20g/L白糖，PH值为5.8；
③海风藤不定芽的增殖培养
将步骤②诱导培养后的腋芽转接到不定芽增殖培养基上，进行增殖培养40天，再将腋芽分切成一节节带芽部分并将其转接到不定芽增殖培养基上，如此循环操作，可获得大量海风藤不定芽；所述不定芽增殖培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
④海风藤不定芽的增殖壮苗培养
将步骤③增殖培养后的不定芽转接到增殖壮苗培养基上，进行壮苗培养40天，使植株长高长壮并产生若干丛生苗；所述增殖壮苗培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
⑤海风藤不定芽的生根培养
将经步骤④壮苗培养后的丛生苗转接到生根培养基上，进行生根培养40天，使幼苗基部长出3条以上根系，即可进行海风藤组培苗的驯化和移栽；所述生根培养基的配方为：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L琼脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值为5.8。
所述步骤②、③、④、⑤中的培养条件为：培养温度为25±2℃，散光光照时间为12小时/天，光照强度为2000lx。
步骤①中所述剪取海风藤新长出的前5节藤茎为可常年剪取。所述30％代森锰锌悬浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均为质量百分含量。
所述MS即MS培养基。
所述1/2MS即1/2MS培养基，是指将MS配方中大量元素减半，其它不变而配置的培养基。
所述6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，所述KT即激动素。
实施例3
一种海风藤离体快速繁殖方法，具体步骤如下：
①外植体的预处理、选取和消毒
选择长势旺盛的健康海风藤，喷施30％代森锰锌悬浮液800倍液，每周喷施一次，连续3次；然后剪取海风藤新长出的前5节藤茎，将其藤茎剪成3～5cm的带芽茎，用洗洁精水溶液清洗干净，晾干备用；在超净工作台上用72％乙醇溶液浸泡32秒，再用无菌水冲洗2次，用无菌滤纸吸干；再用0.1％升汞溶液消毒，前2节嫩茎消毒8min，后3节藤茎消毒108min，再用无菌水清洗3遍，然后用无菌滤纸吸干后备用；
②海风藤腋芽诱导培养
将步骤①处理后的外植体转接到腋芽诱导培养基上，进行诱导培养35天，诱导出高为3～5cm的腋芽；所述腋芽诱导培养基的配方为：1/2MS+5.5g/L琼脂+20g/L白糖，PH值为5.8；
③海风藤不定芽的增殖培养
将步骤②诱导培养后的腋芽转接到不定芽增殖培养基上，进行增殖培养35天，再将腋芽分切成一节节带芽部分并将其转接到不定芽增殖培养基上，如此循环操作，可获得大量海风藤不定芽；所述不定芽增殖培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
④海风藤不定芽的增殖壮苗培养
将步骤③增殖培养后的不定芽转接到增殖壮苗培养基上，进行壮苗培养35天，使植株长高长壮并产生若干丛生苗；所述增殖壮苗培养基的配方为：MS+0.2mg/L 6-BA+1.0mg/L KT+10mg/L多效唑+5.5g/L琼脂+30g/L白糖，PH值为5.8；
⑤海风藤不定芽的生根培养
将经步骤④壮苗培养后的丛生苗转接到生根培养基上，进行生根培养35天，使幼苗基部长出3条以上根系，即可进行海风藤组培苗的驯化和移栽；所述生根培养基的配方为：MS+0.3mg/L KT+5.5g/L琼脂+30g/L白糖+0.2％活性炭，PH值为5.8。
所述步骤②、③、④、⑤中的培养条件为：培养温度为25±2℃，散光光照时间为12小时/天，光照强度为2000lx。
步骤①中所述剪取海风藤新长出的前5节藤茎为可常年剪取。所述30％代森锰锌悬浮液、72％乙醇溶液、0.1％升汞溶液均为质量百分含量。
所述MS即MS培养基。
所述1/2MS即1/2MS培养基，是指将MS配方中大量元素减半，其它不变而配置的培养基。
所述6-BA即6-苄氨基腺嘌呤，所述KT即激动素。
上述实施例仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于本发明的保护范围。