本发明属于植物栽培领域，具体涉及基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法。
背景技术：
龙脑樟属樟科( Lauraceae)樟属( Cinnamomum)亚热带阔叶林植物，樟科植物多含有龙脑。樟科植物资源非常丰富，我国约有46种和1变种，根据其精油组成成分及含量的差异，樟树可分为5个化学类型即脑樟、芳樟、油樟、异樟、龙脑樟，同一种内可分为几个不同的化学型，其中龙脑樟则是种特异类型，它是由樟树自然授粉群体中发现的。龙脑樟的叶片富含精油，含油率为2%左右，叶部精油的主要成分右旋龙脑（天然冰片）最高含量为87%，这是到目前为止从植物中提取冰片得率最高的。天然冰片 ( Borneolum )又名龙脑、龙脑香、梅花冰片、梅花脑等，是一种中医常用的名贵珍稀药材和高级香料，具有开窍醒神、清热止痛等功效，配制中成药的重要药物，也是日用化工和食品工业中的高档添加剂。主产于印度尼西亚、菲律宾、印度、马来西亚，我国历来依靠进口来满足需要，最近这几年的天然冰片资源缺乏，大多采用天然合成。
由江西吉安市林科天然冰片厂生产的天然冰片已列入2005版、2010版和2015版的《中华人民共和国药典》标准，并使《药典》中冰片增加为3种，其中冰片为合成龙脑（机制冰片），艾片为左旋龙脑，天然冰片为右旋龙脑。因此，利用樟树龙脑樟的树叶来生产天然右旋龙脑, 是目前我国最佳天然植物资源。
繁育栽培方面：目前多采用常规的种子繁殖或扦插繁育，显然难以避免受到繁殖率低且易出现性状分离、母树的优良性状难以保持、扦插繁育易受母树枝条数和栽培环境等的限制。
自然环境下通过种子繁育的龙脑樟子代约有20～60%不发生变异，且龙脑樟的种子数量少，因而分类培育和经营必须在苗期进行分类剔除其它类型的苗木。从鲜叶中提取精油，不同的个体间其含量和主要成分不同，差异程度可达50%以上，不利于用来提纯，不能作为天然冰片资源进行培育；而有些优良个体鲜叶精油右旋龙脑含量达91%，樟脑含量不到1%。因此，要选择优良的母树必须要先营造优质龙脑樟原料林。此类方法耗时长久、工作量巨大、投入成本与产出存在较大的违背性，不适宜繁殖龙脑樟苗木。
利用龙脑樟叶片右旋龙脑含量高及樟树萌发能力强的特性，研究培育鲜枝叶，利用鲜枝叶加工生产天然冰片。江西吉安市林业科学研究所开展了龙脑樟扦插育苗方法；修剪龙脑樟穗条长6～8公分，将底部平剪，顶部留一片叶或半片叶，消毒后浸泡在生根粉营养液中；选取酸性土壤进行松土、杀菌、施肥，浇水，并清理掉周围的阳光遮挡物；在晴天低温下，将穗条扦插入土中，叶片朝同一方向着齐，芽苞置于土壤表层一公分，每株行距及株距为5公分；扦插后再次给龙脑樟穗条消毒，喷生根粉营养液，浇水，并插上竹片盖上白色薄膜给其进行密封，保证其中的湿度达标；盖上遮阴率为80%以上的遮阴网，四周边固定，封垅后至少30天不得揭开遮阴网及其白色薄膜。本方法采用扦插繁殖的育苗方法进行龙脑樟优良类型苗木繁殖，具有繁殖时间为4～6个月、种苗纯度高、成活率最高可达50%，同时病虫害多、死亡率高，也影响着苗木的质量。
以上两种方法的缺点显著，不能满足大量引种繁殖的需要。
在专利“一种龙脑樟组织培养方法（申请号：201510180211）”中，于每年4～5月份取龙脑樟当年新抽半木质化枝条，剪取具有2～3个叶片的枝条，去除叶片后，置于无菌水中振荡洗涤3～5分钟，再用70% 的酒精处理1～2分钟，置于0.1 %升汞6～10分钟，再用无菌水清洗3次；将处理的半木质化枝条接种到不定芽诱导培养基中，获得无菌外植体，光照培养条件下培养后，形成用于扩繁的愈伤组织和不定芽；再经过继代增殖扩繁培养基、诱导生根培养基的培养，培育得到生根苗；将经以上培养的龙脑樟生根苗移栽，成活率95%以上。此方法不仅需要多次更换不同类型培养基，而且需要较长时间（4～5个月）才可获得完整苗木。
本发明针对以上等现有组织培养技术所存在的问题，利用带腋芽的茎段作为外植体，经过表面消毒、一体三步法培养，最终在较短时间（1.5～2个月）内获得大量的龙脑樟组培苗。使用自主研发配制的一体三步法培养基一次性便可诱导出完整的龙脑樟苗木。在与传统组织培养技术获得同等繁殖倍数的苗木的前提下，即节省了药品、人工、劳动力等成本，又缩短了培养时间，提高了组织培养效率。这种龙脑樟组织培养技术即保存了苗木的优质性，繁殖出大量具有保持母本优良品质的龙脑樟植株，又满足引种推广的需求；与常规种子繁殖、扦插、组培繁殖等繁殖技术相比，此法有效地提高龙脑樟的繁殖效率，保持了母本的优良性状，不易产生性状变异。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种基于一体三步法的龙脑樟再生体系的快速建立方法，该方法不仅提高了龙脑樟的繁殖倍数，缩短生长周期，提高繁殖系数，而且增加了根系活力，提高了组培成苗的质量，为龙脑樟组培快繁研究提供了一种思路、方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4～6个腋芽的茎段作为外植体，将其经过表面消毒后用一体三步法培养，最终获得完整龙脑樟组培苗。
所述方法具体包括以下步骤：
(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有3～8个节间的长茎段作为外植体，用软毛刷轻刷表皮泥土及粉尘，进行表面消毒处理后，将其切成0.3～1 cm带节间的单茎段备用；
(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7 d后诱导出芽点，15 d后诱导出0.8～1.5 cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长15 d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养20～30 d后，当苗高长至2.5～4 cm后，准备炼苗、移栽；
(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内1～2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1～3天，期间每天要补充10～15 ml无菌水至瓶内，此后将培育出的组培苗夹出，洗净根部培养基，准备移栽；
(4)移栽：用800 ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30 min后，取出，用稀黄土水沾根后，移栽入酸性土壤的移植袋中生长，待苗木长至6～8 cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；
(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度 15～28 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度70～85%，覆盖遮阴率 80%遮阳网，每周喷洒1 次杀菌剂，每半月施一次氮、磷、钾复合肥。
步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为 0.1～0.2%洗洁精的水中浸泡30 min后，流动的水冲洗2～3 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒10～30 s，无菌水冲洗3～5次，再用0.1 wt.%升汞消毒10～20 min，无菌水冲洗3～5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
培养基A配方为：改良MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
培养基B配方为：1/2改良MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L +活性炭1 g/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
环境Ⅰ为：温度25±2 ℃、光强2000～3000 Lx、12 h/d光照不间断培养。
环境Ⅱ为：在黑暗条件、温度为23±2 ℃下培养。
环境Ⅲ为：温度25 ℃、光强1500～2000 Lx、8 h/d光照不间断培养。
所述杀菌剂为：50% 多菌灵与70% 甲基托布津交替使用。
本发明的优点在于：
在传统的扦插繁殖、组织培养的方法基础上，以多节间茎段作为外植体，使用自主研发配制的一体三步法培养基短时间、一次性便可诱导出完整的龙脑樟苗木。此方法解决了传统繁殖方法存在的培育步骤过多、周期过长，时间过久、转接过程易被感染等问题，即节省了药品、人工、劳动力等成本，又缩短了培养时间，同时避免了因转接过程感染细菌而产生的材料浪费等情况，提高了龙脑樟的组织培养效率与质量。
本发明所用的外植体为龙脑樟多节间茎段，通过使用自主研发配制的一体三步法一次性组织培养诱导的方法来获得龙脑樟再生植株，按本发明所培育的龙脑樟植株生根成苗率为100%，移栽成活率为98%以上。本方法中龙脑樟的仅为1.5～2个月组培成苗时间可使繁殖倍数达20倍，降低了龙脑樟无性繁殖技术的生产成本，提高繁殖倍数与成活率，为龙脑樟产业的开发利用及推广提供了新的技术。
具体实施方式
实施例1
(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有5个节间的茎段作为外植体，后用软毛刷轻刷表皮，将其进行表面消毒处理后，切成含有单个节间的茎段备用；
(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7 d后诱导出芽点，15 d后诱导出1 cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长15 d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养25 d后，当苗高长至3 cm后，准备炼苗、移栽；
(3)炼苗：将经过（2）培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1天，期间每天要补充12 ml无菌水至瓶内，第4天后将组培苗轻轻夹出，洗净根部培养基，以备移栽；
(4)移栽：用800 ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30 min后，取出，用稀黄土将其根部包裹成鸡蛋大小后，移栽入酸性土壤的小移植袋中生长，待苗木长至7 cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达99%以上；
(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度 22 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度 80%，覆盖遮阴率 80%遮阳网，每周喷洒1 次杀菌剂，每月浇1次营养液。
步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为0.1%洗洁精的水中浸泡30 min，流动的水冲洗3 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒20 s，无菌水冲洗4次，再用0.1 wt.%升汞消毒15 min，无菌水冲洗4次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
培养基A配方为：改良MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
培养基B配方为：1/2改良MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L +活性炭1 g/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
环境Ⅰ为：温度25±2 ℃、光强2500 Lx、12 h/d光照不间断培养。
环境Ⅱ为：在黑暗条件、温度为24 ℃下培养。
环境Ⅲ为：温度25 ℃、光强1700 Lx、8 h/d光照不间断培养。
所述杀菌剂为：50% 多菌灵与70% 甲基托布津交替使用。
按本发明所培育的龙脑樟植株生根成苗率为100%，移栽成活率为99%以上。
实施例2
(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有4个多节间的长茎段作为外植体，后用软毛刷轻刷表皮，将其进行表面消毒处理后，切成含有单个节间的茎段备用；
(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7 d后诱导出芽点，20 d后诱导出1.5 cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长13 d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养20 d后，当苗高长至3.5 cm后，准备炼苗、移栽；
(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内1天，第3天将瓶盖打开后继续放置1天，期间每天要补充10 ml无菌水至瓶内，第4天后将组培苗轻轻夹出，洗净根部培养基，以备移栽；
(4)移栽：用800 ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30 min后，取出，用稀黄土将其根部包裹成鸡蛋大小后，移栽入酸性土壤的小移植袋中生长，待苗木长至6 cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；
(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度 19 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度 70%，覆盖遮阴率 80%遮阳网，每周喷洒1 次杀菌剂，每半月施一次氮、磷、钾复合肥。
步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为 0.1%洗洁精的水中浸泡30 min，流动的水冲洗2 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒10 s，无菌水冲洗3次，再用0.1 wt.%升汞消毒10 min，无菌水冲洗3次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
培养基A配方为：改良MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
培养基B配方为：1/2改良MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L +活性炭1 g/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
环境Ⅰ为：温度26 ℃、光强2000 Lx、12 h/d光照不间断培养。
环境Ⅱ为：在黑暗条件、温度为25 ℃下培养。
环境Ⅲ为：温度25 ℃、光强1500 Lx、8 h/d光照不间断培养。
所述杀菌剂为：50% 多菌灵与70% 甲基托布津交替使用。
按本发明所培育的龙脑樟植株生根成苗率为100%，移栽成活率为98%以上。
实施例3
(1)表面消毒：选取龙脑樟当年生半木质化无病虫害的枝条，去其叶片，剪成具有6个节间的茎段作为外植体，后用软毛刷轻刷表皮，将其进行表面消毒处理后，切成含有单个节间的茎段备用；
(2)一体三步法培养：将经过(1)处理的外植体接种入培养基A中，外植体按其原植株生长方向竖插于培养基中，在环境Ⅰ中培养7 d后诱导出芽点，20 d后诱导出2.0 cm丛生芽；将丛生芽按单芽分割开之后接种至培养基B中，移入环境Ⅱ中生长17 d后，诱导出不定根；之后再将其更换入环境Ⅲ中，培养15 d后，当苗高长至4 cm后，准备炼苗、移栽；
(3)炼苗：将经过（2）中培养的瓶苗从培养室取出放置常规室内2天，第3天将瓶盖打开后继续放置1天，期间每天要补充15 ml无菌水至瓶内，第4天后将组培苗轻轻夹出，洗净根部培养基，以备移栽；
(4)移栽：用800 ppm多菌灵溶液将洗净根部培养基的龙脑樟组培苗浸泡30 min后，取出，用稀黄土将其根部包裹成鸡蛋大小后，移栽入酸性土壤的小移植袋中生长，待苗木长至8 cm后，再将其移栽入酸性土壤的栽培基质中定植，成活率达98%以上；
(5)田间栽培管理：将幼苗移栽田间，环境温度28 ℃，喷雾保湿，保持空气湿度85%，覆盖遮阴率 80%遮阳网，每周喷洒1 次杀菌剂，每月浇1次营养液。
步骤（1）中表面消毒处理为在含体积浓度为0.2%洗洁精的水中浸泡30 min，流动的水冲洗3 h，置于超净工作台上用70 wt.%酒精消毒30 s，无菌水冲洗5次，再用0.1 wt.%升汞消毒20 min，无菌水冲洗5次后，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分。
培养基A配方为：改良MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
培养基B配方为：1/2改良MS+IBA 0.3 mg/L+NAA 0.5 mg/L +活性炭1 g/L +蔗糖30 g/L+ 琼脂粉 7 g/L，pH值为5.8；所述改良MS为MS基本培养基中仅硝酸铵成分减为825 mg/L，其它成分不变。
环境Ⅰ为：温度24 ℃、光强3000 Lx、12 h/d光照不间断培养。
环境Ⅱ为：在黑暗条件、温度为23 ℃下培养。
环境Ⅲ为：温度25 ℃、光强2000 Lx、8 h/d光照不间断培养。
所述杀菌剂为：50% 多菌灵与70% 甲基托布津交替使用。
按本发明所培育的龙脑樟植株生根成苗率为100%，移栽成活率为98%以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。