专利名称：龙脑樟规模化繁殖的生产方法
技术领域：
本发明涉及植物繁殖技术领域,具体为一种龙脑樟[Cinnamomum camphora(L.)Sie]规模化繁殖的生产方法。
背景技术：
龙脑樟为樟科樟属植物，常绿大乔木。原产印度尼西亚的苏门答腊群岛，是一种珍贵的富含芳香油类的药用香料树种和园林绿化树种，亦是重要的化工原料和冰片(右旋龙脑)的天然植物资源(天然冰片是一种名贵中药材和高级香料，亦是一种有效的透皮促进齐U，其具有抗炎、抗心肌缺血、抗菌、止疼、防腐等作用)(程必强等，1997)。长期以来对龙脑樟的开发利用多以提取精油为主，过度采伐导致其资源严重破坏，尤其是优树资源趋于枯竭。近年来其人工林发展规模急剧扩大，市场上对于龙脑樟优质苗木的需求不断增长。要加速龙脑樟的产业开发，必须建立规模化的苗木和原料林基地，如何使龙脑樟优良母株的各种优良性状在后代个体中遗传性稳定，提高成活率和生长整齐度，是实现龙脑樟种苗产业开发、生产关键技术。龙脑樟传统的繁殖是采用种子育苗法，但种子繁殖最大的缺陷是后代个体变异性非常大，母株的诸多优良性状，如高龙脑含量及抗病丰产性能在后代中很难稳定延续。采用组织培养技术不仅能克服上述缺陷，同时在短期内即可获得大量优质苗木。目前龙脑樟的组织培养研究主要集中在无性系的建立方面，其大量优良苗木组培快繁体系还不够完善。而且，一直存在龙脑樟组织培养中无菌材料难以获得，快繁增殖系数低、生根苗根系差、容易脱叶、木质程度不够等导致田间种植成活率低等客观事实，大大限制了龙脑樟组织培养产业的发展。因此,需要对外植体培养技术,外植体无菌材料建立,增殖生根培养基配方研究、切割方法、培养条件等进行研究，提高快繁系数和最后种植成活率。
发明内容
本发明提供了一种龙脑樟规模化繁殖的生产方法，可有效解决龙脑樟在组织培养中存在繁殖系数低、生根苗根系不旺、木质化程度不够、田间种植成活率低等问题。一种龙脑樟规模化繁殖的生产方法，其特征在于包括如下步骤步骤I、母株选择、外植体培育与预处理在春季，选择优良、健壮、无病虫害、经测定药效成份稳定且右旋龙脑含量高的多年生龙脑樟为原种，从该龙脑樟原种上截取一年生的枝条作为扦插母本，在该扦插母本上剪取半木质化或已木质化枝条作为插穗，每个插穗带I 2个节，经过消毒处理后扦插到基质中；待插穗成活，其根系完整、新芽长出且有新叶抽后，移到盆/钵中放置温室进行常规扦插苗养护；当插穗的腋芽抽起10 15cm、枝条未木质化时，即可采集作为外植体,每个外植体长度约I 2. 5cm ；步骤2、无囷材料犾得将采集好的外植体切去截面变色部分，接种于经灭菌好的4/5改良MS培养基中，、培养条件为温度25±1· 5°C，光照时间14±2H/D，光照强度3. 75-6. 25 μ mo I · m_2 · s'培
养周期4 5周；所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. Γ1改为等量的Ca (NO3) 2· 4Η20,再添加朽1 樣酸 50mg · L \6-BA 2. 0-6. Omg · L \ NAA O. 1-0. 5mg · L \鹿糖30g · L—1、卡拉胶 5. 5g · L'pH 5. 7 ；步骤3、无菌材料的驯化与继代扩繁
第一代无菌材料培养后，当顶芽抽出或茎段抽起长度大于20mm时，以I 2节为单位进行切割；当有侧芽分化时，以2 4芽团进行方向性切割，将切割好的芽团接种于经灭菌好的3/4改良MS培养基中，培养条件为温度26±2°C，光照时间14±2H/D，光照强度18. 75-22. 5 μ mo I · m 2 · s S 培养周期 4 6 周；所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. Γ1改为等量的Ca (NO3) 2· 4Η20,再添加朽1 樣酸 50mg · L \6-BA 2. 0-3. Omg · L \ NAA O. 1-0. 5mg · L \鹿糖30g · L—1、卡拉胶 5. 5g · L'pH 5. 7 ；经上述2 3次转代培养后即完成驯化，进入扩繁阶段进入扩繁阶段的芽继代材料为12-20个芽/团，继代时，按3-4芽/团切割，当芽丛上的枝条高于20mm时，保留下方1-2节去顶后，接种于3/4MS改良培养基中，扩繁系数为3. 5-5. 5 ；所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. Γ1改为等量的Ca (NO3) 2· 4Η20,再添加朽1 樣酸 50mg · L \6-BA I. 0-3. Omg · L \ NAA O. 1-0. 5mg · L \鹿糖30g · L—1、卡拉胶 5. 5g · L'pH 5. 7 ；步骤4、壮苗生根培养将经扩繁培养后的芽团按2-4芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基中，培养条件为温度26土 1°C，光照时间14±2H/D，光照强度31.25-37.5μπι01 · m_2 · s_\培养周期5 7周；该壮苗培养基为3/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸50mg -Γ1,6-BA O. 01-0. 5mg · L \ NAA O. 1-0. 3mg · L \活性炭 300_500mg · L \鹿糖 25g · L \卡拉胶 6. Og · L'pH 5. 7 ；当壮苗培养后团块上的芽达到20_35mm、具有两片完整叶且叶片平展时，切下来接种到生根培养基中，培养条件为温度25±1°C，光照时间14±2D，光照强度31. 25-45. 5 μ mo I · m 2 · s 1 ；该生根培养基为1/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸50π^· ΛIBA l-3mg · L' NAA O. 2-0. 5mg · L' 活性炭 300_500mg · L' 鹿糖 25g .L' 卡拉胶7. Og · L'pH 5. 7 ；选择根数3 6条，植株高度达40 65mm以上，具有4片完整叶，长势健壮的作为生根苗；步骤5、温室种植将生根苗移至温室进行炼苗7-10天后取出，将其根部的培养基清洗干净，无菌处理后种植至基质中，种植2-3个月即可。由于成年母株枝干的木质程度快，若作为外植严重影响无菌体的获得率，延长了诱导驯化周期。因此，本发明采用抗病强、无病虫害、经检测药用成份稳定和平均含量高的成年优良母树的当年生木质化枝条经独特扦插处理而获得的成活小植株，将该植株培育一年左右，利用其当年萌发的芽作为外植体。选择最佳的季节4月，当新枝抽出约20厘米时，对植株停止浇水、浇肥2-5天，目的是提高无菌外植体的获得率。为了保证再生植株具有母本的所有性状，即为了保持性状的稳定性、遗传性，采用顶芽或侧芽作为外植体；壮苗生根是为了让植株抽高长根，有利于后期的植株成活。本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基进行优化改良，可以有效保证材料的稳定生长，芽大小均匀，不会产生组培苗玻璃化或脱叶现象，保证组培苗的健壮稳定获得，重复性强，驯化周期，继代周期稳定，减轻褐化提高扩繁系数，提高温室种植成活率，满足大规模生产的需要；且本发明的继代团块切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，团块过小时，易出现褐化导致死亡，芽数过多培养后的后代芽细弱，会玻璃化；如芽过高不去顶，则培养后主芽顶端优势明显，扩繁系数也会降低。本发明对组培苗各阶段的培养条件进行了优化，保证其培养能够稳定生长，尤其是生根苗不断 加强光照度的值的确认，有利于组培苗木质植物木质化程度加强，提升其筛苗的成活率。
具体实施例方式本发明一种龙脑樟规模化繁殖的生产方法，具体包括如下步骤步骤I、母株选择、外植体培育与预处理在春季，选择优良、健壮、无病虫害、经测定药效成份稳定且平均含量高(如右旋龙脑82%以上)的多年生龙脑樟为原种，从该龙脑樟原种上截取一年生的枝条作为扦插母本，在该扦插母本上剪取半木质化或已木质化枝条作为插穗，每个插穗带I 2个节,经过500ppm的朽1檬酸处理I分钟，转入含IBA200ppm的无菌液中浸泡20分钟后,扦插到基质中，该基质由粗度0 IOmm的泥炭土和珍珠岩以2 I的配比混合而成。待插穗成活，其根系完整、新芽长出且有新叶抽后，移到盆/钵中放置温室进行常规扦插苗养护。当插穗的腋芽抽起10 15cm、枝条未木质化时，即可采集作为外植体,每个外植体长度约I 2. 5cm,在采集外植体前需对插穗停止浇水、浇肥2 5天，待基质表面干燥或发白即可。步骤2、无菌材料获得将采集好的外植体装于保鲜袋中，在组培室用0. 05%的清洗溶液漂洗3_5min后，用流水冲洗干净转入净化工作台上，用0. I %升汞消毒8-12min后，再用无菌水漂洗3_5次，每次3-5分钟。将漂洗好的外植体切去截面变色部分，接种于经灭菌好的4/5改良MS培养基中，培养条件为温度(25±1. 5) °C，光照时间14±2H/D，光照强度3. 75-6. 25 u mo I m_2 s—1，培养周期4 5周；本发明中所有的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20440mg. L—1改为等量的 Ca (NO3) 2. 4H20，再添加柠檬酸 50mg *r\6-BA2. 0-6. Omg .L'NAA 0. 1-0. 5mg .L'鹿糖 30g L'卡拉胶 5. 5g L' pH 5. I0步骤3、无菌材料的驯化与继代扩繁经过试验多次论证，采用春季萌发的新梢作为外植体，可大大缩短后期的驯化周期，外植体褐化程度低，无菌外植体获得率也比较高，可高达92. 0%。
第一代无菌材料培养后，当顶芽抽出或茎段抽起长度大于20mm时，以I 2节为单位进行切割；当有侧芽分化时，以2 4芽团进行方向性切割，将切割好的芽团接种于经灭菌好的3/4改良MS培养基中，培养条件为温度(26±2) °C，光照时间14±2H/D，光照强度 18. 75-22. 5 μ mo I · m 2 · s \ 培养周期 4 6 周。所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. Γ1改为等量的Ca (NO3) 2· 4Η20,再添加朽1 樣酸 50mg · L \6-BA 2. 0-3. Omg · L \ NAA O. 1-0. 5mg · L \鹿糖30g · L—1、卡拉胶 5. 5g · L'pH 5. 7 ；经上述2 3次转代培养后即完成驯化，进入扩繁阶段进入扩繁阶段的芽继代材料为12-20个芽/团，继代时，按3-4芽/团切割，当芽丛上的枝条高于20mm时，保留下方1-2节去顶后，接种于3/4MS改良培养基中，扩繁系数为3. 5-5. 5，可满足于产业化的需求；所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. L—1改为等量的 Ca (NO3) 2· 4H20,再添加朽1 樣酸 50mg · L \6-BA I. 0-3. Omg · L \ NAA O. 1-0. 5mg · L \鹿糖30g · L—1、卡拉胶 5. 5g · L'pH 5. 7 ；以上继代团块的切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，团块过小时，易出现褐化导致死亡，芽数过多培养后的后代芽细弱，会玻璃化；如芽过高不去顶，则培养后主芽顶端优势明显，扩繁系数也会降低。步骤4、壮苗生根培养将经扩繁培养后的芽团按2-4芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基中，培养条件为温度(26±1)°C，光照时间14±2H/D，光照强度31. 25-37. 5 μ mo I · m_2 · s—1，培养周期5 7周。该壮苗培养基为3/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸50mg -Γ1,6-BA O. 01 O. 5mg · L \ NAA O. 1-0. 3mg · L \ 活性炭 300_500mg · L \ 鹿糖 25g · L \ 卡拉胶 6. Og · L—1、pH 5. 7。当壮苗培养后团块上的芽达到20_35mm、具有两片完整叶且叶片平展时，切下来接种到生根培养基中，培养条件为温度(25±1) °C，光照时间14±2D，光照强度31. 25-45. 5 μ mol · m 2 · s、培养周期 6 7 周。该生根培养基为1/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸SOmg·!/1，IBA l-3mg · L' NAA O. 2-0. 5mg · L' 活性炭 300_500mg · L' 鹿糖 25g .L' 卡拉胶7. Og · L'pH 5. 7。生根培养10天后开始长根，4-6周后长根率达99%，根数3 6条，植株高度达40 65mm以上，具有4片完整叶，长势健壮，最后两周加强光照，保证组培苗木质化加强，有利出瓶后期的种植成活率提升。选择根数3 6条，植株高度达40 65mm以上，具有4片完整叶，长势健壮的作为生根苗。步骤5、温室种植将生根苗移至温室进行炼苗7-10天后取出，将其根部的培养基清洗干净，用2000倍液的农用链霉素+2000倍液的青霉素钠浸泡3-5分钟，捞起稍微滴水后种植，将泥炭土和珍珠岩按3 I混合后作为种植基质，将生根苗种植后遮荫、保湿，温度18 25度，湿度80 90%，适当通风，种植2-3个月即可达到出货标准株高8-12cm，4片以上完整叶，地茎粗0. 3cm，成活率可达93. 7%以上。由于本发明采用优良、健壮、无病虫害、经测定药效成份稳定且含平均含量高的多年生龙脑樟为原种，从原种截取一年生枝条经扦插成活后培育母株，从母株上采集未木质化的嫩芽作为外植体，这样保证母株遗传性状稳定，组培快繁时可减轻褐化，提高无菌外植体获得率，有利于后期的产业化生产的稳定；本发明在春季采集外植体，有利于缩短驯化周期，材料生长相对较快，容易提高扩繁系数稳定；本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基进行优化改良，可以有效保证材料的稳定生长，芽大小均匀，不会产生组培苗玻璃化或脱叶现象，保证组培苗的健壮稳定获得，重复性强，驯化周期，继代周期稳定，减轻褐化提高扩繁系数，提高温室种植成活率，满足产业生产需要；本发明的继代团块切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，团块过小时，易出现褐化导致死亡，芽数过多培养后的后代芽细弱，会玻璃化；如芽过高不去顶，则培养后主芽顶端优势明显，扩繁系数也会降低。本发明对组培苗各阶段的培养条件进行了优化，保证其培养能够稳定生长，尤其是生根苗不断加强 光照度的值的确认，有利于组培苗木质植物木质化程度加强，提升其筛苗的成活率。以上所述，仅是本发明较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
权利要求
1.一种龙脑樟规模化繁殖的生产方法，其特征在于包括如下步骤 步骤I、母株选择、外植体培育与预处理 在春季，选择优良、健壮、无病虫害、经测定药效成份稳定且右旋龙脑含量高的多年生龙脑樟为原种，从该龙脑樟原种上截取一年生的枝条作为扦插母本，在该扦插母本上剪取半木质化或已木质化枝条作为插穗，每个插穗带I 2个节,经过无菌处理后扦插到基质中；待插穗成活，其根系完整、新芽长出且有新叶抽后，移到盆/钵中放置温室进行常规扦插苗养护；当插穗的腋芽抽起10 15cm、枝条未木质化时，即可采集作为外植体,每个外植体长度约I 2. 5cm ;在采集外植体前需对插穗停止浇水、浇肥2 5天，待基质表面干燥或发白即可； 步骤2、无菌材料获得 将采集好的外植体切去截面变色部分，接种于经灭菌好的4/5改良MS培养基中，培养条件为温度25±1. 5°C，光照时间14±2H/D，光照强度3. 75-6. 25 u mo I m_2 s—1，培养周期4 5周； 所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. L—1改为等量的Ca (NO3) 2- 4H20,再添加朽1 樣酸 50mg L \6-BA 2. 0-6. Omg L \ NAA 0. 1-0. 5mg L \鹿糖30g L—1、卡拉胶 5. 5g L'pH 5. 7 ； 步骤3、无菌材料的驯化与继代扩繁 第一代无菌材料培养后，当顶芽抽出或茎段抽起长度大于20_时，以I 2节为单位进行切割；当有侧芽分化时，以2 4芽团进行方向性切割，将切割好的芽团接种于经灭菌好的3/4改良MS培养基中，培养条件为温度26±2°C，光照时间14±2H/D，光照强度.18. 75-22. 5 u mo I m 2 s S 培养周期 4 6 周； 所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. L—1改为等量的Ca (NO3) 2- 4H20,再添加朽1 樣酸 50mg L \6-BA 2. 0-3. Omg L \ NAA 0. 1-0. 5mg L \鹿糖30g L—1、卡拉胶 5. 5g L'pH 5. 7 ； 经上述2 3次转代培养后即完成驯化，进入扩繁阶段进入扩繁阶段的芽继代材料为12-20个芽/团，继代时，按3-4芽/团切割，当芽丛上的枝条高于20mm时，保留下方1-2节去顶后，接种于3/4MS改良培养基中，扩繁系数为3. 5-5. 5 ； 所述的改良MS培养基指的是，将习知的MS中的CaCl2. 2H20 440mg. L—1改为等量的Ca (NO3) 2- 4H20,再添加朽1 樣酸 50mg L \6-BA I. 0-3. Omg L \ NAA 0. 1-0. 5mg L \鹿糖30g L—1、卡拉胶 5. 5g L'pH 5. 7 ； 步骤4、壮苗生根培养 将经扩繁培养后的芽团按2-4芽/团方向性切割后，接种到壮苗培养基中，培养条件为温度26±1°C，光照时间14±2H/D，光照强度31. 25-37. 5 u mo I m_2 s'培养周期5 7周； 该壮苗培养基为3/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸50mg L—1，6-BA 0. 01-0. 5mg L \ NAA 0. 1-0. 3mg L \活性炭 300_500mg L \鹿糖 25g L \卡拉胶 6. Og L'pH 5. 7 ； 当壮苗培养后团块上的芽达到20-35mm、具有两片完整叶且叶片平展时，切下来接种到生根培养基中，培养条件为温度25±1°C，光照时间14±2D，光照强度·31. 25-45. 5 u mo I m 2 s 1 ； 该生根培养基为1/4改良MS培养基，在习知的MS培养基中添加柠檬酸50mg IBA·l_3mg L' NAA 0. 2-0. 5mg L'活性炭 300_500mg I/1、鹿糖 25g L'卡拉胶 7. Og L'pH 5. 7 ； 选择根数3 6条，植株高度达40 65mm以上，具有4片完整叶，长势健壮的作为生 根苗； 步骤5、温室种植 将生根苗移至温室进行炼苗7-10天后取出，将其根部的培养基清洗干净，无菌处理后 种植至基质中，种植2-3个月即可。
全文摘要
本发明一种龙脑樟规模化繁殖的生产方法，采用抗病强、无病虫害、经检测药用成份稳定和平均含量高的成年优良母树的当年生木质化枝条，经独特扦插处理而获得的小植株经培育一年左右，利用其当年萌发的芽作为外植体，无菌材料获得后，对无菌材料进行驯化与继代扩繁，然后进行壮苗生根培养，最后温室培养出幼苗，本发明对诱导、扩繁、壮苗、生根的培养基进行优化改良，可以有效保证无菌材料的稳定生长，芽大小均匀，不会产生组培苗玻璃化或脱叶现象，保证组培苗的健壮稳定获得，重复性强，驯化周期，继代周期稳定，减轻褐化提高扩繁系数，提高温室种植成活率，且本发明的继代团块切割方法，决定了后期材料的长势与扩繁系数，能满足大规模生产的需要。
文档编号A01H4/00GK102630459SQ20121011302
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者叶清梅, 张天进, 李雪, 杨双霞, 陈柳红, 陈艳红, 黄雨花 申请人:泉州市泉美生物科技有限公司