利用生物反应器进行多肉植物繁殖的方法与流程

本发明涉及植物扩繁技术领域，具体涉及一种利用生物反应器进行多肉植物繁殖的方法。

背景技术：

多肉植物又称多浆植物、肉质植物，是指在植物营养器官中至少有一器官具有发达的薄壁组织以储藏水分，外型比一般植物显得肥厚、膨大和多汁。2012年根据瑞士国际多肉植物协会专家的统计，多肉植物隶属于83科、690属，约12500种。我国常见栽培的有60余科，逾万种。多肉植物最早风靡于日本、韩国等东亚国家，目前在这些国家已经形成了完整的、较成熟的培育筛选产业。近年来，国内多肉植物市场还在持续不断升温，但在多肉植物的科研领域还处于初级阶段，大部分集中在引种驯化阶段，也有人开始了组培、育种等方面的研究。北京、上海、厦门、天津等地的一些植物园和经营者在多肉植物的科研方面走在了前列，尚未形成技术优势，无法与国外的多肉产品相抗衡。目前，虽然有部分企业陆续开始通过组织培养途径开展多肉植物的快速繁殖，但是受困于多肉植物材料易玻璃化和生长速度缓慢等技术难题，无法建立组织培养体系。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种利用生物反应器进行多肉植物繁殖的方法，有效地避免了多肉植物组织培养过程中常见的玻璃化和生长速度缓慢等问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

利用生物反应器进行多肉植物繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)外植体灭菌及诱导

取外植体消毒灭菌后接种于诱导培养基中，诱导产生胚性愈伤组织；

(2)生物反应器增殖

将诱导产生的胚性愈伤组织接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中，暗光培养2～4个周期，获得大量胚性材料；

(3)干燥与萌发

将步骤(2)获得的胚性材料置于无菌条件下，用干燥、无菌气流脱水4-8h，然后置于光照条件下，于无菌干燥瓶中继续脱水培养1-2个月；然后将脱水培养的胚性材料接种于萌发培养基中，1-2个月后形成正常丛生芽；

其中，萌发培养基的组成为：MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂8～10g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8；

(4)壮苗与移栽

将步骤(3)培养的正常丛生芽接种于壮苗培养基中，培养为可移栽的丛生苗，进行移栽即可。

进一步，在步骤(2)中，将诱导产生的胚性愈伤组织接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中，暗光培养2个周期，获得大量嫩绿色胚性材料。

更进一步，在步骤(2)中，将诱导产生的胚性愈伤组织接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中，暗光培养3～4个周期，获得大量无色透亮胚性材料。

更进一步，在步骤(3)中，在无菌干燥瓶中脱水培养过程中，无色透亮胚性材料逐渐形成内部中空的丛生体细胞胚胎。

更进一步，所述壮苗培养基的组成为：1/2MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+活性炭0.5g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

更进一步，在步骤(2)中，所述生物反应器的气流量保持在300ml·min^-1。

更进一步，所述外植体为种子，灭菌后的种子在诱导培养基中培养3个月后，逐渐长成完整植株，取该植株的叶片接种于继代培养基中，1～3个月后，诱导产生胚性愈伤组织。

更进一步，所述外植体为从母株采集的叶片，将该叶片置于清洁、通风、干燥的环境中，7d后，待叶柄伤口处形成保护层，于连续晴日的中午，将叶片置于肥皂水中浸泡20min，然后流水冲洗1h，之后在超净工作台中进行灭菌，将灭菌后的叶片接种于诱导培养基中，1～3个月后，叶片的伤口处形成胚性愈伤组织。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明对增殖培养的胚性材料进行干燥处理，可有效改善胚性愈伤组织的玻璃化状态及生长速度慢等问题，使生物反应器增殖获得的胚性材料能够正常分化形成丛生芽，继而培养成正常植株。

2、利用本单位发明的生物反应器对胚性愈伤组织进行增殖培养，能够在短期内实现材料的快速增殖，提高正常芽得率；并且操作简单，实现了增殖培养的机械化操作，减少人工成本，提高培养效率。

3、通过体细胞胚胎途径进行繁殖，1个体细胞胚胎即可培养分化为一株苗，可在相对较短的时间内实现材料的大量增殖。

附图说明

图1为诱导产生的玻璃化胚性愈伤组织；

图2为体细胞胚胎萌发过程中的生长表现；

图3为体细胞胚胎萌发产生的正常芽。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例一：

利用生物反应器进行多肉植物繁殖的方法，包括如下步骤：

(1)外植体灭菌及诱导

将成熟种子置于无菌三角瓶中，用75％的乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3-5次，然后用15％的次氯酸钠溶液浸泡20min，无菌水冲洗3-5次。将灭菌后的种子接种于诱导培养基中。

诱导培养基可采用常规培养基，本实施例中，诱导培养基的组成为：MS培养基+BA0.5～2mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。其中，BA为6-苄氨基嘌呤。

灭菌后的种子在诱导培养基中培养3个月后，逐渐长成完整植株，取该植株的叶片接种于继代培养基中，1～3个月后，诱导产生胚性愈伤组织。该胚性愈伤组织多为玻璃化状态。

继代培养基可采用常规培养基，本实施例中，继代培养基的组成为：MS培养基+BA0.5～2mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

采用种子作为外植体进行灭菌处理，其消毒灭菌相对于叶片更容易，将灭菌后的种子接种于诱导培养基中，3个月即可生长为完整植株。该植株处于无菌条件下，取该植株的叶片再进行继代培养，可获得大量的无菌材料。

(2)生物反应器增殖

将诱导产生的胚性愈伤组织接种于添加有液体增殖培养基的生物反应器中，气流量保持在300ml·min^-1，暗光培养2个周期，获得大量胚性材料；培养2个周期的胚性材料呈嫩绿色，有较明显的枝叶结构。

生物反应器为现有技术，本实施例中，采用授权公告号为：CN203840895U的中国实用新型专利所公开的生物反应器。在生物反应器中，1个周期为15天。

液体增殖培养基可采用常规培养基，本实施例中，液体增殖培养基的组成为：MS培养基+BA 0.5～2mg·L^-1+NAA 0～0.5mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

(3)干燥与萌发

将生物反应器获得的嫩绿色胚性材料置于无菌条件下，用干燥、无菌气流快速脱水4-8h，然后置于光照条件下，在无菌干燥瓶中进行缓慢脱水及生长1-2个月。当脱水培养的胚性材料略显萎蔫时，接种于萌发培养基中，1-2个月后形成正常丛生芽。

本实施例中，嫩绿色的胚性材料在干燥瓶中培养7天后，嫩绿色转变为深绿色，继续脱水培养，在胚性材料略显萎蔫时，将其接种于萌发培养基中；在萌发培养基中培养14天后，胚性材料逐渐形成少量不定根，在培养1～2个月后，胚性材料长出正常丛生芽。

其中，萌发培养基的组成为：MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂8～10g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

(4)壮苗

将正常丛生芽以2～3个芽为一丛，接种于壮苗培养基中，7天后长出大量不定根，1个月后，长成株高为2厘米，叶色深绿的丛生苗。

壮苗培养基的组成为：1/2MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+活性炭0.5g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

(5)移栽

将生长健壮的丛生苗洗去根部琼脂后，种植于水洗椰糠中，1个月后，即可成活。

实施例二：

与实施例一不同的是，在本实施例中，外植体采用从母株采集的叶片，在进行灭菌之前，先对叶片进行预处理，具体方法如下：将从母株采集的叶片置于清洁、通风、干燥的环境中，7天后，待叶柄伤口处形成保护层，于连续晴日的中午，将叶片置于肥皂水中浸泡20min，然后流水冲洗1h，之后在超净工作台中进行灭菌，灭菌方法与种子相同。最后将灭菌后的叶片接种于诱导培养基中，1～3个月后，在叶片伤口处形成胚性愈伤组织。

在进行叶片灭菌之前，先进行预处理，使叶柄伤口处形成保护层，防止叶片含水量太高而发生腐烂。将叶片作为诱导材料诱导产生胚性愈伤组织，不需要对植株进行培养，可直接获取诱导材料，大大减少工作量及培养时间。

实施例三

与实施例一和实施例二不同的是，在本实施例中，诱导产生的胚性愈伤组织在生物反应器中增殖培养的时间为3～4个周期。培养3～4个周期的胚性材料，呈无色透亮，枝叶膨大成团状。

在本实施例中，将增殖培养的时间延长至3～4个周期，胚性愈伤组织在生物反应器中实现大量增殖，并且由于培养时间延长，胚性材料呈无色透亮，枝叶膨大成团状。

将培养3～4个周期的无色透亮胚性材料进行如下步骤的操作：

(3)干燥与萌发

将获得的无色透亮的胚性材料置于无菌条件下，用干燥、无菌气流快速脱水4-8h，然后置于光照条件下，在无菌干燥瓶中进行缓慢脱水及胚胎生长1-2个月，期间无色透亮的胚性愈伤组织逐渐形成内部中空的丛生体细胞胚胎。

本实施例中，胚性材料在干燥瓶中培养7天后，无色透亮的胚性材料逐渐转变为黄绿色，随着培养时间的延长，再逐渐变为深绿色。直至无色透亮的胚性材料逐渐形成内部中空的丛生体细胞胚胎。

在深绿色的体细胞胚胎出现脱水，且少量体细胞胚胎黄化时，将体细胞胚胎接种至萌发培养基中，1～2个月后，体细胞胚胎开始萌发，在其顶端长出深绿色正常叶片。

其中，萌发培养基为在MS培养基中加入如下配方的物质，并保持PH值为5.8：

由上述配方可知，BA和蔗糖对体细胞胚胎玻璃化影响较小，琼脂对其玻璃化影响较大，琼脂的主要作用是控制体细胞胚胎的吸水速度，既使其不能大量吸收水分，又不至于缺水。由配方1～配方3可知，当琼脂添加量较小时，接触培养基的体细胞胚胎吸收水分较多，吸水迅速，将产生较多的玻璃化丛生芽；当琼脂添加量较大时，未接触培养基的体细胞胚胎吸收水分较少，生长速度较为缓慢。在配方1～配方3中，可对因接触培养基而产生的玻璃化丛生芽继续培养，玻璃化丛生芽可转变为正常芽。在对比配方1中，由于琼脂添加量过小而导致接触培养基和未接触培养基的体细胞胚胎均迅速吸水，产生大量玻璃化丛生芽而无法产生正常芽。

(4)壮苗

将2-3个丛生体细胞胚胎萌发的芽为一丛接种于壮苗培养基中，7d后长出不定根，1个月后，长成株高2cm，叶色深绿的丛生苗。

壮苗培养基的组成为：1/2MS培养基+BA 0～0.5mg·L^-1+琼脂7g·L^-1+活性炭0.5g·L^-1+蔗糖30g·L^-1，PH值为5.8。

(5)移栽

将生长健壮的丛生苗洗去根部琼脂后，种植于水洗椰糠中，1个月后，即可成活。

多肉植物均可采用本发明方法进行离体组织培养，如玫瑰、雪莲、爪系、玉露、厚叶等，以提高多肉植物的繁殖速度，降低培养成本，在短期内获得大量性状稳定、无菌的多肉植物幼苗。

最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。