本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法，属生物
技术领域：
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：柳枝稷(PanicumvirgatumL.)属禾本科黍属，是美国本土多年生的C4草本植物。柳枝稷植株高大，具有根系发达、防风固沙能力强、耐瘠薄等优点，对土壤环境要求低，一直以来作为饲草来用。近年来，因其生物量大、易降解等特性而被作为能源植物进行开发利用，因此又有“能源草”的称谓。我国自20世纪80年代开始进行柳枝稷的引种、试种，科研工作者通过育种技术对柳枝稷的一些不良性状进行改良，以更加适宜当地种植并提高经济效益。然而，柳枝稷是一种异型杂交的多倍体单子叶植物，具有高度的自交不亲和性，通过常规育种技术对其某些性状进行改良十分困难。因此，通过基因工程技术对柳枝稷进行遗传改良获得变得尤为重要，而基因工程技术的应用前提是建立高效的植物组织培养体系。目前，转基因技术在柳枝稷新品种培育方面已取得较大进展。柳枝稷组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的柳枝稷组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过抑菌的方法来改造培养基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够获得柳枝稷的正常生长。这样，一方面可以降低柳枝稷组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展柳枝稷组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对柳枝稷生长产生毒害或抑制，即不影响柳枝稷的正常生长，从根本上简化了柳枝稷组织培养。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、愈伤组织增殖、分化培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+3～6mg/L2,4-D+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+0.5～2mg/L环丝氨酸+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；愈伤组织增殖培养基为：MS+2～4mg/L2,4-D+0.5～2mg/L6-BA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+0.5～2mg/L环丝氨酸+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+0.2～1mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+0.2～1mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+0.5～2mg/L环丝氨酸+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.5～1mg/LNAA+40～100mg/L次氯酸钠+1～5mg/L乳酸链球菌素+0.5～2mg/L环丝氨酸+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述2,4-D，指2,4-二氯苯氧乙酸；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述NAA，指α-萘乙酸；所述GA3，指赤霉素；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：选取田间生长健壮无病虫害的植株，剥取1～1.2cm的幼穗，用体积比为75％的乙醇进行表面消毒1min，再用质量体积比为0.1％的升汞溶液灭菌5～8min，无菌水冲反复冲洗不少于3次；在超净工作台上，将处理好的幼穗切成长度为不超过3mm的小段，接种到诱导培养基中，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.愈伤组织增殖：将诱导出的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基中，每15d转接一次，大量增殖；培养室温度为26℃，暗培养；6.分化培养：将愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出小芽，小芽逐步发育成不具根的幼苗；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；7.生根培养：取高度为2～3cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；8.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃；所述透水性好的基质，如草木灰:沙子:耕作土＝1:1:1。本发明的应用效果：本发明的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基是无需高温高压灭菌。因此，在柳枝稷诱导培养、增殖培养、生根培养的各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法与常规的柳枝稷组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段，外植体诱导率无明显差异。表1本发明的抑菌组培方法对柳枝稷诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数诱导率(％)常规组培方法923265.2抑菌组培方法953365.32.愈伤组织增殖培养：本发明的抑菌组培方法与常规组培柳枝稷的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率二个指标都差异不显著。表2本发明的抑菌组培方法对柳枝稷增殖倍数和污染率的影响组培方式增殖倍数平均污染率(％)常规组培方法5.60.4抑菌组培方法5.80.33.分化培养：在分化培养过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的柳枝稷组培方法相比，分化率差异不显著，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，抑菌组培苗生长效果更好，结果如表3所示。表3本发明的抑菌组培方法对柳枝稷愈伤组织分化率和污染率的影响组培方式平均分化率(％)平均污染率(％)常规组培方法820.3抑菌组培方法830.24.在组培苗生根过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的柳枝稷组培方法相比，由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其柳枝稷组培苗生根效果更好，结果如表4所示，生根率和污染率的差异不显著。表4本发明的抑菌组培方法的柳枝稷瓶苗生根情况组培方式生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法850.7抑菌组培方法870.65.成本分析：本发明的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表5。本发明组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。常规组培还需要添置高压锅等设备及日常维护，且存在实验室安全等问题。表5本发明的柳枝稷简便组培方法与常规组培的成本分析表本发明具有如下有益效果：1.本发明的柳枝稷抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了柳枝稷组培技术环节，降低了柳枝稷组培成本。2.本发明的柳枝稷抑菌组培方法，操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。3.本发明的柳枝稷抑菌组培方法与常规的柳枝稷组培方法对比，可以降低成本10％以上。具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例一：一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法一种利用抑菌培养基培育柳枝稷的组培方法，包括以下步骤：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+5.0mg/L2,4-D+60mg/L次氯酸钠+3.0mg/L乳酸链球菌素+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；愈伤组织增殖培养基为：MS+3.0mg/L2,4-D+0.1mg/L6-BA+60mg/L次氯酸钠+3.0mg/L乳酸链球菌素+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；分化培养基为：MS+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA+0.5mg/LGA3+60mg/L次氯酸钠+3.0mg/L乳酸链球菌素+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为1/2MS+0.8mg/LNAA+60mg/L次氯酸钠+3.0mg/L乳酸链球菌素+1.0mg/L环丝氨酸+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：选取田间生长健壮无病虫害的低地型柳枝稷品种Alamo，剥取1cm的幼穗，用体积比为75％的乙醇进行表面消毒1min，再用质量体积比为0.1％的升汞溶液灭菌5～8min，无菌水冲反复冲洗3次。在超净工作台上，将处理好的幼穗切成长度为不超过3mm的小段，接种到诱导培养基中，培养30d后诱导出愈伤组织；培养室温度为26℃，暗培养；5.愈伤组织增殖：将诱导出的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基中，每15d转接一次，可以达到大量增殖的效果；培养室温度为26℃，暗培养；6.分化培养：将愈伤组织转入分化培养基中，30d后逐步诱导出小芽，小芽逐步发育成不具根的幼苗；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；7.生根培养：取高度为2～3cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照16h，光照强度为2000Lx；8.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的基质中(草木灰：沙子：耕作土＝1:1:1)，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。当前第1页1 2 3