一种笃斯越桔组培快繁的方法及其培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种笃斯越桔组培快繁的方法及其培养基。本发明所提供的用于获得笃斯越桔再生植株的培养基，由以下成分组成：NH4NO3、Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、肌醇、维生素B1、烟酸、维生素B6、甘氨酸、Na2?EDTA、FeSO4·7H2O、吲哚丁酸、矮壮素、蔗糖和蒸馏水。针对笃斯越桔组培苗木细弱现象，本发明首次提出了将矮壮素加入培养基，配合植物激素，促进笃斯越桔组培苗复壮的方法，该方法可以通过增强组培苗木质化程度，增强其抗逆能力，以提高苗木移栽后的成活率。同时，本方法提出了用育苗袋辅助移栽，该方法使笃斯越桔组培苗的移栽成活率达到100％。
【专利说明】
一种笃斯越桔组培快繁的方法及其培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术，特别涉及一种笃斯越桔组培快繁的方法及其培养 基。
【背景技术】
[0002] 笃斯越桔（Vaccinium ul iginosum)，又名都柿、甸果等，是一种杜鹊花科 (Ericaceae)越桔属(Vaccinium)的可食用的有色衆果，其果实深蓝，口感细腻，果香怡人。 研究表明，笃斯越桔具有抗氧化、抗衰老、抗癌、预防心血管疾病、保护视力等功效，具有极 佳的保健功效。在我国，笃斯越桔集中分布在大小兴安岭及长白山地区，其中大兴安岭地区 为其最大的天然分布区。调查显示，大兴安岭地区笃斯越桔的天然分布面积有15万公顷以 上，年储量约2万吨。但是，在利益的驱动下，我国的野生笃斯越桔遭到了破坏式的开发。人 类往往以折枝撸叶的方式破坏性的采收笃斯越桔果实，对其自然生境造成了不可逆的损 伤。据报道，我国野生笃斯越桔已过早地出现了资源退化、种群面积缩小的现象，笃斯越桔 已可列入濒危植物类群。因此，有必要采取措施，建立笃斯越桔资源保护体系。其中，可实施 性强、见效快的保护措施就是建立笃斯越桔资源回植项目，即人工培育笃斯越桔苗木，并将 其回植到资源遭到破坏的相应原产区，以保证资源开发的可持续性，保护森林生态结构。
[0003] 目前，已有研究报道笃斯越桔再生体系的建立，现有体系可以实现笃斯越桔的再 生。但是，由于笃斯越桔组培苗茎杆普遍纤细，且其瓶内生根较为困难，生根耗时长(通常为 40-90天），且根较细弱。同时，笃斯越桔组培苗移栽相关研究较为欠缺，成活率较低。该现状 无形增加了笃斯越桔育苗成本，极大地限制了笃斯越桔工厂化育苗的进程，制约了笃斯越 桔资源保护成效。
【发明内容】
[0004] 为了弥补以上领域的不足，本发明提供了一种笃斯越桔组培快繁的方法及其培养 基。
[0005] 本发明所提供的用于获得笃斯越桔再生植株的培养基，由以下成分组成：
[0006] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN03、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H2〇、MnS〇4 · 4H2〇、ZnS〇4 · 7H2〇、 H3B03、CuS〇4 · 5H2〇、NaMo〇4 · 2H2〇、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2_EDTA、 FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壮素、蔗糖和蒸馏水；
[0007] 以上成分在所述培养基中浓度分别为：
[0008] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H2〇 0.684g/L、KN03 〇· 19g/L、KH2P〇4 〇· 17g/L、 MgS〇4.7H2〇 0.37g/L、MnS〇4.4H2〇 22.3mg/L、ZnS〇4.7H2〇 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H2〇 0.25mg/L、NaMo〇4.2H2〇 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2_EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 吲噪丁酸〇 · lmg/L-0 · 5mg/L、矮壮素 Omg/L-lOmg/L和鹿糖20g/L。
[0009] 所述用于获得笃斯越桔再生植株的培养基由以下成分组成：
[0010] NH4N〇3、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H2〇、MnS〇4 · 4H2〇、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壮素、蔗糖和蒸馏水；
[0011]以上成分在所述用于获得笃斯越桔再生植株的培养基中浓度分别为：
[0012] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 吲噪丁酸〇 · 5mg/L、矮壮素5mg/L和鹿糖20g/L。
[0013] 本发明还提供了一种用于获得笃斯越桔再生植株的固体培养基，是由凝固剂和所 述用于获得笃斯越桔再生植株的培养基配成的固体培养基。
[0014] 所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为9g/L;
[0015] 所述凝固剂为琼脂。
[0016]所述培养基的pH值为5.4。
[0017] 本发明还提供了一种获得笃斯越桔再生植株的方法，包括如下步骤：
[0018] 将笃斯越桔再生苗接种到所述用于获得笃斯越桔再生植株的固体培养基上进行 生根诱导，即得到笃斯越桔再生植株。
[0019] 所述方法还包括将所述笃斯越桔再生植株移栽至装有栽培基质苗盆中，用育苗袋 辅助移栽的步骤。
[0020] 所述育苗袋是上部带有自封条，下部开口的透明、硬质塑料口袋，其下部开口与苗 盆口径大小一致；
[0021] 所述用育苗袋辅助移栽是用育苗袋套住苗盆，密封育苗袋上部的自封条，并用橡 皮筋扎住育苗袋下部，保证该栽培环境的密封性；
[0022]所述栽培基质为体积比为3:1的草炭土:蛭石。
[0023]所述笃斯越桔再生苗是通过包括以下步骤的方法得到的：
[0024]用分化诱导培养基诱导笃斯越桔无菌苗分化，培养得到笃斯越桔再生苗；
[0025] 所述分化诱导培养基由以下成分组成：
[0026] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸馏水；
[0027] 以上成分在所述培养基中浓度分别为：
[0028] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 玉米素 1 · Omg/L-2 · 5mg/L、吲噪丁酸 Omg/L-O · 5mg/L 和鹿糖 20g/L。
[0029] 所述分化诱导培养基由以下成分组成：
[0030] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸馏水；
[0031] 以上成分在所述培养基中浓度分别为：
[0032] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H2〇 27.8mg/L、 玉米素1 · Omg/L、吲哚丁酸0 · lmg/L和蔗糖20g/L。
[0033] 通常矮壮素可外施以限制作物疯长，有促进坐果的功效。针对笃斯越桔苗木细弱 现象，本发明首次提出了将矮壮素加入培养基，配合植物激素，促进笃斯越桔组培苗复壮的 方法，该方法可以通过增强组培苗木质化程度，增强其抗逆能力，以提高苗木移栽后的成活 率。
[0034] 另外，由于笃斯越桔组培苗移栽初期，其根系及枝叶仍处于恢复、适应期，其对外 界的防御力较弱，特别是水分保持能力较差。因此，有必要提供空气湿度较高、空气流动较 少的稳定环境以保证笃斯越桔组培苗移栽成活。介于上述背景，本发明提出了一种低成本、 可重复使用且操作方便的育苗袋的制作和使用（图3)。该育苗袋可以保证笃斯越桔组培苗 移栽环境的气流及湿度的稳定，配合本发明提出的笃斯越桔瓶内生根、壮苗方法，可使笃斯 越桔组培苗移栽成活率达100 %。
【附图说明】
[0035] 图1为不同培养基对笃斯越桔组培苗的分化诱导情况。
[0036]图2为不同培养基对笃斯越桔组培苗的生根诱导情况；其中A为对照；B为添加 IBA 0· lmg/L ;C为添加 IBA 0.5mg/L;D为添加 IBA 0.5mg/L+矮壮素5mg/L。
[0037] 图3为本发明提出的育苗袋及其育苗效果；其中，A为移栽后用育苗袋扣盆培养;B 为培养2个月后的生长状态。
[0038] 图4为笃斯越桔组培苗移栽2个月后的生长情况;其中，A为未进行瓶内生根即覆膜 移栽;B为瓶内生根后覆膜移栽;C为瓶内生根后用育苗袋辅助移栽。
【具体实施方式】
[0039] 仪器及试剂:超净工作台（北京东联哈尔），IBA(吲噪丁酸，Beta-indolebutyric acid)，ZT(玉米素，Zeatin)、2,4D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、TDZ(噻苯隆， Thidiazuron)、NAA(萘乙酉爱，1-Naphthaleneacetic acid)、6BA(6_Benzylaminopurine)、矮 壮素、琼脂粉、蔗糖均购自北京科创欣达科技有限公司，其余未特别标明的试剂都购自北京 化工公司。
[0040] 实验材料:笃斯越桔无菌苗。野生笃斯越桔采自大兴安岭地区，以其强壮枝条的当 年生嫩茎为外植体，借助组织培养技术，诱导腋芽再生，获得无菌的组培苗用于后续实验。 该无菌苗可从中国科学院植物研究所花卉生理与遗传育种研究组获得。记载过笃斯越桔 (大兴安岭区野生种)的非专利文献是:顾姻，贺善安，於虹，王传永，吴文龙(2001)蓝浆果与 蔓越桔(第1版）.北京：中国农业出版社.PP. 25-33，142-187。
[0041] 实施例1、笃斯越桔高效组培快繁及移栽的方法
[0042] -、配制笃斯越桔诱导分化培养基和生根培养基
[0043] 1、配制改良WPMo基础培养基：
[0044] 量取50mL改良WPM大量元素母液、5mL改良WPM微量元素母液、5mL改良WPM有机物母 液、5mL改良WPM铁盐母液、20mg蔗糖，混匀，用硫酸或者磷酸调节pH至5.4，并定容终体积至 1000ml;添加9g琼脂，121°C高温灭菌20min，放凉至65°C左右，备用。
[0045] 本实施例所配制的改良WPM母液配方如表1所示：
[0046] 表1本实施例所配制的改良WPM母液配方
[0049] 备注:所有的试剂配好后都置于4°C冰箱保存。
[0050] 2、配制用于笃斯越桔分化诱导和生根诱导的激素
[0051] 分别称取 10mg ZT(玉米素，Zeatin)、IBA(吲噪丁酸，Beta-indolebutyric acid)、 2，4D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、TDZ(噻苯隆，Thidiazuron)、NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneacetic acid)、6BA(6_Benzylaminopurine)粉末，并分别用纯乙醇定容至 10ml;称取10mg矮壮素粉末，用蒸馏水定容至10ml;将上述激素在超净台中，用0.22μηι滤头 过滤灭菌。灭菌后的激素置于4°C贮存，备用。此后的所有操作均在超净台中进行，所用工具 均为121°C，灭菌20min后的物品。
[0052] 3、制备用于笃斯越桔分化诱导的培养基
[0053] (1)在超净台中将灭过菌的基础培养基改良WPMo混匀后分装至组培瓶中，每瓶约 50ml ；
[0054] (2)依照表2,向分装好的培养基中加入相应激素，混匀后，静置，待其凝固后使用； 每种培养基制备至少3瓶；
[0055] 表2本实施例所配制的分化诱导培养基配方
[0058] 改良WPMo基础培养基由以下成分组成：
[0059] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20；
[0060] 以上成分在改良WPMo基础培养基中浓度分别为：
[0061] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0· 19g/L、KH2P〇4 0· 17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L。 [0062] 4、制备用于笃斯越桔生根诱导的培养基
[0063] (1)在超净台中将灭过菌的基础培养基改良WPMo混匀后分装至组培瓶中，每瓶约 50ml ；
[0064] (2)依照表3,向分装好的培养基中加入相应激素，混匀后，静置，待其凝固后使用； 每种培养基制备至少3瓶；
[0065] 表3本实施例所配制的生根诱导培养基配方
[0068] 改良WPMo基础培养基由以下成分组成：
[0069] NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7H20、 H3B03、CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、 FeS04 · 7H20；
[0070] 以上成分在改良WPMo基础培养基中浓度分别为：
[0071] NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2 · 4H20 0.684g/L、KN03 0·19g/L、KH2P〇4 0·17g/L、 MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4.4H20 22.3mg/L、ZnS〇4.7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、 CuS〇4.5H20 0.25mg/L、NaMo〇4.2H20 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 B1 0.1mg/L、烟酸 0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L。
[0072] 二、笃斯越桔的分化诱导
[0073] (1)待分化诱导培养基冷却、凝固后，切取笃斯越桔无菌苗，分别接入表2的笃斯越 桔分化诱导培养基；
[0074] (2)将组培苗放置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1条件下培养30-40(1，诱导 其分化，得到笃斯越桔再生组培苗。
[0075]三、笃斯越桔组培苗的生根培养
[0076] (1)用锋利的剪刀将高度约3-4cm的笃斯越桔再生组培苗剪下，竖直插入笃斯越桔 生根诱导培养基中，每瓶接入30株；
[0077] (2)将接种后的组培瓶置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1条件下培养30-40(1 后统计并分析数据。
[0078]四、笃斯越桔生根苗的移栽
[0079] (1)取出已生根的笃斯越桔组培苗，用流水洗净其根部的培养基(注意该清洗步骤 需轻缓操作，以免洗断根）；
[0080] (2)将洗净的笃斯越桔生根苗移栽至栽培基质为草炭土:蛭石= 3:1的苗盆中（提 前将栽培基质浇透水），按表4进行相应的覆膜或套育苗袋处理，每种处理至少包含100株 苗;将定植后的苗木置于20(±5)°(：，120011，光照周期1611/(1条件下培养30-40(1后统计并分 析数据。
[0081 ]表4本实施例所进行的移栽管护方法
[0083]五、结果
[0084] (1)由于笃斯越桔叶片薄且小，其在操作过程中很容易褐化、干枯，因此相比于叶 片，笃斯越桔的嫩茎更适于用作外植体，诱导不定芽再生。实验结果（图1，表5)表明，对于笃 斯越桔的分化诱导，TDZ及玉米素(ZT)具有重要作用，而2,4D无效。向含有2.0mg/L TDZ的培 养基中添加低浓度的NAA或者IBA可有效促进笃斯越桔分化。本发明表明同时加有TDZ及IBA 的培养基DSF1能够促进培养物高效分化，其中笃斯越桔外植体的切口处及任何与培养基接 触的叶尖部分均有遍布红色芽点的愈伤组织生成，且外植体的腋芽处也萌生了大量再生 芽。同时加有TDZ及NAA的培养基DSF2也可诱导大量愈伤组织生成，但是该愈伤大多仅在切 口处产生，分化再生效果不及DSF1。但DSF1及DSF2培养基中的再生苗都存在生长缓慢，伸长 难的问题，需要及时更换能够促进苗木伸长的继代培养基。而对于枸杞等植物具有较好分 化诱导效果的2,4D则不适用于笃斯越桔，接于该培养基上的外植体无法分化产生再生芽， 也无法萌生腋芽，多数逐渐老化、干枯死亡。
[0085]表5笃斯越桔分化诱导结果
[0086]
[0087] ZT具有高效的分化诱导作用，常被用于难分化的植物的分化诱导。本研究表明随 着ΖΤ浓度从0.5-2.5mg/L变化，笃斯越桔的分化率也随之增高。较低浓度的玉米素（彡 〇. 5mg/L)能够很好地促进外植体腋芽萌发，且其伸长速度较快，外植体与培养基接触处可 形成少量愈伤组织;较高浓度的玉米素（1 -2.5mg/L)能够刺激外植体高水平地分化，在ZT终 浓度为2.5mg/L的培养基中，延长培养时间，笃斯越桔的分化率可超100。但是，随着分化水 平的提高，分化苗出现玻璃化的几率也在增加，且高浓度玉米素分化得到的组培苗茎杆过 于纤细，不易移栽成活。因此，l.〇mg/L的玉米素是诱导笃斯越桔分化的最佳浓度，且向其中 添加低浓度的IBA(0.1 -0.5mg/L)有一定的壮苗作用，可减少苗木纤细程度，但高浓度的IBA 会抑制外植体分化及伸长。另外，与加有TDZ的培养基相比，加有ZT的培养基可以诱导笃斯 越桔高效分化产生大量再生芽，且该再生芽可同时快速伸长。因此加有ZT的培养基可同时 用以继代培养，减少培养基配制工作的繁复度，缩短笃斯越桔组培育苗周期。综上，添加有 ZT 1 .Omg/L及IBA 0. lmg/L的改良WPMo培养基（即培养基DSF9)为笃斯越桔最佳分化诱导培 养基。
[0088] (2)低浓度的IBA(0.1-0.5mg/L)能够有效促进笃斯越桔组培苗进行瓶内生根，高 浓度的IBA(1.0-2.0mg/L)对其生根具有明显抑制作用，且IBA浓度越高，抑制作用越明显 (图2,表6)。此外，由于笃斯越桔组培苗通常较为纤细，抗逆水平较差，为增加其移栽时的成 活率，本研究在其生根培养基中添加了一定剂量的矮壮素，辅助壮苗，减少苗木疯长，促进 其茎杆粗壮。结果表明在IBA浓度水平较低时(O.lmg/L)，同时添加矮壮素会显著抑制生根， 使生根率降低了50 %以上;在IBA浓度水平较高时（1. Omg/L)，同时添加矮壮素的抑制效果 则不会过于明显；而在IBA水平适中（0.5mg/L)时，添加低剂量的矮壮素可以促进生根，且能 够有效促进组培苗木质化程度的增加。因此本研究筛选出改良WPMo基础培养基添加 IBA 0.5mg/L+矮壮素5mg/L为其最佳生根诱导培养基(SG8)，生根率为81.47 ± 3.48 %。
[0089]表6笃斯越桔组培苗生根诱导结果
[0091] (3)本研究以未进行瓶内生根、壮苗的笃斯越桔组培苗直接进行移栽的移栽成活 率作为对照，分别对比瓶内生根后覆膜移栽和用育苗袋（图3)辅助移栽的移栽效果。移栽30 天后统计成活率，结果（图4)表明，未进行瓶内生根、壮苗的笃斯越桔组培苗其移栽成活率 可达69.37±4.95%，瓶内生根后覆膜移栽的组培苗成活率为73.79±3.00%，而用育苗袋 辅助移栽的苗木成活率可达100%。
[0092] 值得注意的是，移栽60天后再次观察苗木生长状况，发现未进行瓶内生根的组培 苗其成活率下降为54.89±4.01%，比移栽后1各月的数据下降了近15%，且植株高度变化 很少，几乎未增加，但瓶内生根后的组培苗表现为稳定生长。同时，本研究提出的用于辅助 移栽的育苗袋可以在很大程度上维持组培苗生长环境的稳定性，包括空气湿度、温度及空 气流动性，这有利于组培苗出瓶后逐渐适应外界生长环境，提供了较好的过渡空间，极大地 提高了苗木成活率，且植株生长速度较快。本研究中，用所述育苗袋辅助移栽法移栽了 150 余株笃斯越桔组培苗，均已成活，且长势喜人。
[0093]结果表明，本发明提出的笃斯越桔分化培养基能够诱导组培苗高效分化，且本发 明提出的在培养基中添加矮壮素及IBA的笃斯越桔组培苗瓶内生根方法在促进笃斯越桔瓶 内生根的同时（生根率可达80%以上），可以实现壮苗，大幅提高笃斯越桔组培苗的木质化 程度，能够有效增加笃斯越桔组培苗移栽时的抗逆能力，且该方法操作简单，应用性强。同 时，本发明方法提出了育苗袋辅助组培苗移栽的方法，该方法能够实现笃斯越桔组培苗 100 %的移栽成活率，若用于工厂化育苗，可大幅提高企业成苗率，减少企业成本，具有好的 应用价值。同时，该育苗袋设计简单，操作方便，且可以重复利用。此外，该育苗袋适用于各 种形状的苗盆器具，也可以用于其他珍稀材料的培育，具有较好的推广价值。概括而言，本 发明将笃斯越桔组培苗的出苗移栽周期从60d以上缩短至30-40d(从生根培养算起），且在 诱导组培苗生根的同时完成了壮苗过程，配合使用育苗袋使得笃斯越桔组培苗移栽成活率 提高至100%，所以，本方法对于笃斯越桔工厂化育苗及其它组培苗木细弱、生根困难及移 栽难活等植物的培育具有重要意义。
【主权项】
1. 一种用于获得笃斯越桔再生植株的培养基，由以下成分组成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、吲哚丁酸、矮壮素、蔗糖和蒸馏水； 以上成分在所述培养基中浓度分别为： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 BI 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4*7H20 27.8mg/L、吲哚丁酸O.lmg/ L-O · 5mg/L、矮壮素 Omg/L-lOmg/L 和鹿糖 20g/L。2. 根据权利要求1所述的用于获得笃斯越桔再生植株的培养基，其特征在于:所述培养 基由以下成分组成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS04 · 7H20、吲哚丁酸、矮壮素、蔗糖和蒸馏水； 以上成分在所述培养基中浓度分别为： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 BI 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、吲哚丁酸0.5mg/ L、矮壮素5mg/L和鹿糖20g/L。3. -种用于获得笃斯越桔再生植株的固体培养基，是由凝固剂和权利要求1或2所述的 培养基配成的固体培养基。4. 根据权利要求3所述的固体培养基，其特征在于： 所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为9g/L; 所述凝固剂为琼脂。5. 根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于： 所述培养基的pH值为5.4。6. -种获得笃斯越桔再生植株的方法，包括如下步骤： 将笃斯越桔再生苗接种到权利要求3-5中任一所述的培养基上进行生根诱导，即得到 笃斯越桔再生植株。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述方法还包括将所述笃斯越桔再生植株移栽至装有栽培基质苗盆中，用育苗袋辅助 移栽的步骤。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于： 所述育苗袋是上部带有自封条，下部开口的透明、硬质塑料口袋，其下部开口与苗盆口 径大小一致； 所述用育苗袋辅助移栽是用育苗袋套住苗盆，密封育苗袋上部的自封条，并用橡皮筋 扎住育苗袋下部，保证该栽培环境的密封性； 所述栽培基质为体积比为3:1的草炭土:蛭石。9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述笃斯越桔再生苗是通过包括以下步骤的方法得到的： 用分化诱导培养基诱导笃斯越桔无菌苗分化，培养得到笃斯越桔再生苗； 所述分化诱导培养基由以下成分组成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸馏水； 以上成分在所述培养基中浓度分别为： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 BI 0.1mg/L、烟酸0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、玉米素 1.0mg/L-2 · 5mg/L、吲噪丁酸 Omg/L-O · 5mg/L 和鹿糖 20g/L。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述分化诱导培养基由以下成分组成： NH4N03、Ca(N〇3)2 · 4H2〇、KN〇3、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、MnS〇4 · 4H20、ZnS〇4 · 7Η20、Η3Β〇3、 CuS〇4 · 5H20、NaMo〇4 · 2H20、肌醇、维生素 Bl、烟酸、维生素 B6、甘氨酸、Na2-EDTA、FeS〇4 · 7H20、玉米素、吲哚丁酸、蔗糖和蒸馏水； 以上成分在所述培养基中浓度分别为： NH4NO3 0.4g/L、Ca(N03)2.4H2〇 0.684g/L、KN03 (hl9g/L、KH2P〇4 0.17g/L、MgS〇4.7H20 0.37g/L、MnS〇4*4H20 22.3mg/L、ZnS〇4*7H20 8.6mg/L、H3B03 6.2mg/L、CuS〇4*5H20 0.25mg/L、NaMo〇4· 2H2O 0.25mg/L、肌醇 100mg/L、维生素 BI O.lmg/L、烟酸0.5mg/L、维生素 B6 0.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、FeS〇4.7H20 27.8mg/L、玉米素 1.0mg/L、 吲哚丁酸〇. lmg/L和蔗糖20g/L。
【文档编号】A01H4/00GK105900843SQ201610306073
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】苏上, 冯成庸, 王亮生
【申请人】中国科学院植物研究所