一种利用胚轴和胚根直接分化不定芽的白术再生体系的制作方法

本发明涉及药材的繁殖技术，具体地说是一种利用胚轴和胚根直接分化不定芽的白术再生体系。

背景技术：

白术( Atractylodes macrocephala Koidz. )属菊科苍术属多年生草本植物，干燥根茎，气清香，味甘苦，性温，主要产于我国的浙江、湖南、湖北和安徽等地（中国药典2010），于潜所产品质最佳，特称“于术”。《神农本草经》中第一次载有白术的药用价值，被列为上品。白术是我国传统的中药之一，其有效化学成分包括挥发油和多糖等。挥发油中主要含有苍术醇、苍术酮、倍半萜类化合物等。挥发油、内酯等化合物具有较强的生物活性。白术具有抗肿瘤，促进胃肠运动，调节胃肠功能紊乱的作用（陈晓萍等,2011年），具有健脾益气，抗老年痴呆抗衰老抗氧化，提高免疫力，消炎利尿抗凝血的功效（伍乐芹等,2011年），是“健脾丸”、“参苓白术散”、“香砂养胃丸”等中成药品的主要成分。此外，白术尚含有许多种其他有药理学活性的化合物（龙全江等,2004年;陈冰冰,2012年）。同时白术是良好的补气药（杨娥等，2012年）。

目前，野生白术资源濒临灭绝，市场上所用的生药材大部分来自人工种植的白术，而人工栽培白术需经过繁琐的、长时间的育苗过程（王留柱,2009年）。近年来，人们开始使用组织培养快繁技术，这可在较短时间内得到大量白术试管苗来满足白术的标准化生产种植。国内关于白术离体植株再生的报道较少，主要是利用白术侧芽（沈银柱等,1988年;彭菲等,2001年）、叶片（陈娟等,2006年）、茎尖或根状茎（梁小敏等,2009年）萌发幼芽，幼芽作为外植体进行其离体繁殖。该技术与传统的育苗技术相比，大大加快了白术的人工繁殖速度，但其增殖频率较低，而且经过愈伤组织的器官发生使其易产生体细胞遗传变异，从而影响再生植株的品质稳定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用胚轴和胚根直接分化不定芽的白术再生体系，以解决现有白术人工繁殖时间长，频率低，再生植株的品质稳定性较差的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用胚轴和胚根直接分化不定芽的白术再生体系，包括以下步骤：

（a）将白术种子洗净、消毒，将消毒后的白术种子接种于MS培养基中，于25±2℃黑暗处培养至种子萌发，转移至光下继续培养；

（b）培养至株高2-3cm时取出，切取胚根和胚轴，切成长度为0.3-0.5 cm的小块，作为外植体，接种至芽诱导培养基上，在温度为25±2℃、光照时间为14h/d、光照强度为3000-4000 lx诱导培养，使其分化至外植体上生长出2-3cm长的绿芽；所述芽诱导培养基是指在1L的MS培养基中添加了0.5-1.5 mg的TDZ、0-0.5mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂得到的培养基，所述芽诱导培养基的pH值为5.8-6.2；

（c）切下所述绿芽转接至盛有生根培养基的培养瓶中，在温度为25±2℃、光照14 h/d、光照强度3000-4000 lx继续培养，诱导生根，得到再生植株；所述生根培养基是指在1/2MS培养基中添加了0.5mg的NAA或IBA、30g的蔗糖和8g的琼脂得到的培养基，所述生根培养基的pH值为5.8-6.2；

（d）将已经生根且生长状态良好的再生植株取出，移栽至由蛭石∶砂∶营养土的质量比为1∶1∶1组成的灭菌基质中继续栽培，即得白术植株。

步骤（a）所述的光下继续培养的培养温度为25±2℃、光照时间为14h/d、光照强度为3000-4000lx。

步骤（a）所述的消毒是指将洗净后的白术种子在去除种皮前用质量比浓度为0.1%的升汞浸泡种子10 min，无菌水冲洗3-5次，在无菌水中浸泡6 h后，剥去种皮；再用质量比浓度为1.5%的NaClO消毒10 min，无菌水冲洗3-5遍。

优选地，步骤（b）中所述芽诱导培养基是指在1L的MS培养基中添加了1.5 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂得到的培养基。

步骤（a）和步骤（b）所述的MS培养基是通过以下方法制备而成：将 MS大量元素、MS微量元素、MS有机物、30g蔗糖、8g琼脂溶于1L蒸馏水中，调节pH值为5.8-6.2，121℃灭菌15-20min即得。

步骤（c）所述的1/2MS培养基是通过以下方法制备而成：将1/2MS大量元素、MS微量元素、MS有机物、30g蔗糖、8g琼脂溶于1L蒸馏水中，调节pH值为5.8-6.2，121℃灭菌15-20min即得。

本发明利用白术的不同外植体进行不定芽的诱导分化试验，建立了白术的高效离体快速繁殖方法，采用消毒方法获得无菌苗，选取胚轴和胚根这两种特定的外植体，通过特定的芽诱导培养基和生根培养基进行直接诱导分化，建立了白术高效快速再生繁殖体系。本发明提供的再生体系可用于白术的遗传转化和快速离体繁殖，大大提高了白术的增殖频率，缩短了繁殖时间，节约了生产成本，提高了生产效率，为药用白术的大规模生产和品质改良提供了技术支持；而且由于未经过愈伤组织的器官发生，其植株的遗传稳定性更高，这为利用植物基因工程技术改良白术品质、利用离体快速繁殖技术工厂化育苗及脱病毒提供了品质保障。

附图说明

图1为实施例1的步骤（2）中胚根的生长状态图。

图2为实施例1的步骤（2）中胚轴的生长状态图。

图3为实施例1的步骤（3）再生植株的生长状态图。

图4为实施例1的步骤（4）将再生植株移栽至营养土基质后的生长状态图。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。但不以任何形式限制本发明。

MS培养基的配制：将 MS大量元素、MS微量元素、MS有机物、30g蔗糖、8g琼脂溶于1L蒸馏水中，调节pH值为5.8-6.2，121℃灭菌15-20min即得。

1/2 MS培养基的配制：将1/2MS大量元素、MS微量元素、MS有机物、30g蔗糖、8g琼脂溶于1L蒸馏水中，调节pH值为5.8-6.2，121℃灭菌15-20min即得。

实施例1

（1）无菌苗的获得。选取粒大、饱满的白术种子，用流水冲洗干净，用质量比浓度为75%的酒精浸泡1 min后，进行消毒。采用两步法消毒：去除种皮前用质量比浓度为0.1%的升汞浸泡种子10 min，无菌水冲洗3-5次，在无菌水中浸泡6 h后，剥去种皮；再用质量比浓度为1.5%的NaClO消毒10 min，无菌水冲洗3-5遍。消毒后的种子，接种于未添加任何生长调节剂的MS培养基中，于25±2℃黑暗处培养至种子萌发后，转移至光下继续培养，培养温度：25±2℃，光照时间：14h/d，光照强度为：3500 lx。

（2）待白术种子萌发后继续培养1周，待株高为2-3cm时取出，切取胚根和胚轴，作为外植体，切成0.3-0.5 cm的小块，接种至芽诱导培养基上诱导不定芽的分化，培养温度：25±2℃，光照时间：14h/天，光照强度：3000-4000lx；培养30天，分化出了绿芽，统计其每个外植体分化芽个数为13.13±2.75（胚轴）和7.95±1.72（胚根），不定芽分化率分别为91.18%（胚轴）和68.30%（胚根）。其中芽诱导培养基是在1L的MS培养基中添加了1.5 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min后的培养基。

（3）将外植体上生长健壮的2-3 cm长的绿芽切下，转接至盛有生根培养基的培养瓶中，植物材料光照培养条件为25±2℃、光照14 h/d、光照强度3500 lx，诱导生根，得再生植株；其中生根培养基是指在1L的1/2MS培养基中添加了0.5mg的NAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min后的培养基。

（4）将已经生根且生长状态良好的再生植株，打开培养瓶盖，培养间中炼苗2-3 天后小心取出植株，洗净培养基，移栽至按质量比为1∶1∶1的蛭石、砂和营养土混合灭菌基质中，栽培于小钵中，浇透水，薄膜覆盖保湿，注意通风和保持25℃左右的环境温度进行继续培育，得到白术植株。

实施例2

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.0 mg的TDZ、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

实施例3

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了0.5mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

实施例4

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.0 mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

实施例5

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.5 mg的TDZ、0.5mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

实施例6

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.5 mg的TDZ、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

对比例1

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.0mg的6-BA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

对比例2

方法同实施例1，将步骤（2）中“切取胚根和胚轴”改为“切取真叶和子叶”；其诱导培养基的配方同实施例2。

对比例3

方法同实施例1，将步骤（2）中“切取胚根和胚轴芽”改为“切取真叶和子叶”；其诱导培养基的配方同对比例1。

对比例4

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了2.0mg的TDZ、0.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

对比例5

方法同实施例1，仅变动了步骤（2）中芽诱导培养基：在1L的MS培养基中添加了1.5mg的TDZ、1.2mgNAA、30g的蔗糖和8g的琼脂混合，调节pH值为5.8，121℃高压灭菌15 min，制备而成的培养基。

实施例7

在相同培育条件和时间下，统计实施例和对比例中步骤（2）的芽分化率/%和每个外植体平均芽数。统计结果见表1和表2。

表1 实施例和对比例分化不定芽及愈伤组织诱导率的统计

*不同小写字母表示差异显著(P <0.01)

表2 对比例2和3分化不定芽及愈伤组织诱导率的统计

由表1和表2的统计数据可以看出，不同的芽诱导培养基对不定芽分化率的影响很大，其中胚根在不同的培养基中的不定芽分化数目有极显著的差异（P<0.01）；与在芽诱导培养基中添加6-BA相比，无论是胚轴外植体还是胚根外植体，添加TDZ的芽诱导培养基中芽诱导率较高、产生不定芽数目较多；表明TDZ诱导白术外植体产生不定芽的效果更好，但TDZ对真叶和子叶却效果非常差，可见TDZ仅对于分化胚轴和胚根具有适配性。此外，我们从实施例和对比例统计的数据比较发现，胚根和上胚轴外植体不定芽分化率和不定芽个数均受到不同TDZ浓度的显著影响（P <0.01）；当两种外植体不定芽分化率均在TDZ浓度为1.5 mg·L^-1时最高，而当TDZ浓度为2.0mg·L^-1时却表现很不理想；在相同TDZ浓度条件下，上胚轴外植体的不定芽分化率和每个外植体平均分化芽个数均高于胚根外植体；且可以看到NAA浓度较高时，会抑制白术胚根和上胚轴外植体不定芽的分化。

从愈伤组织诱导率方面考虑，胚根和胚轴外植体在实施例1步骤（2）中诱导不定芽，培养至4 周时，胚根和胚轴外植体均从外植体上直接分化出了不定芽，无愈伤组织产生，其胚根的生长状态如图1所示，胚轴的生长状态如图2所示；切取绿芽（不定芽）转栽到生根培养基中诱导生根，培养20天左右，在芽的基部接触培养基的部分出现根原基，25天开始生根，培养40 d后根长可达2-3 cm，其生长状态如图3所示；待白术再生植株根长至2-3 cm 左右时，经炼苗2-3天后，移栽至土壤基质中，其生长状态如图4所示。

此外，实施例1中第（4）步的生根培养基中的“NAA”可用“IBA”替换，其实际效果与实施例1相当。

实施例8

对比例6为2010年陶元景等在《医药生物技术》期刊上发表的“白术茎尖组织培养及快繁技术优化研究”。

对比例7为2006年陈娟等在《中国农学通报》期刊上发表的“白术叶片再生植株和丛生芽快繁的研究”。

本发明提供的方法与对比文件6和对比文件7相比，其实验效果见表3。

表3 本发明与对比文件繁殖频率和繁殖时间的对比结果

从表3的数据可以看出，本发明的繁殖方法较现有的一些外植体的繁殖方法，其繁殖频率更快、繁殖时间更短，无愈伤组织，产品的品质更稳定。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。