专利名称：一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法，尤其是涉及一种适应于甜橙、柠檬、柚、枳橙等品种节间茎段(上胚轴)的高效再生和遗传转化体系。
背景技术：
柑橘是世界第一大水果。世界柑橘年产量超过1亿吨，居各种水果之首；柑橘及其产品的年贸易额达近百亿美元，在农产品贸易额中居第三位。我国柑橘面积超过160万公顷，占世界柑橘总面积的23％，居世界第一位。
柑橘遗传转化是建立在受体系统发展的基础上，具有良好的组织培养再生系统往往是获得成功的关键，柑橘是多年生木本植物，种类品种多，受体系统的品种特异性及再生效率低使柑橘遗传转化受到极大的限制。这些限制给利用基因工程进行柑橘育种带来了较大的困难。因此，为了便于更好地开展柑橘遗传转化研究，必须建立一个完善的柑橘主栽品种再生和遗传转化方法。
发明内容
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本发明的目的在于提供一种甜橙、柠檬、柚、枳橙等柑橘品种高效再生和遗传转化的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，其包括如下步骤(1)种子消毒和萌发将普通溆浦甜橙(或者大红甜橙、柚、柠檬、枳橙)种子从果实中取出后，剥去外种皮和约2/3的内种皮，在70％酒精中浸泡28-32s，0.1％的升汞溶液中浸泡8～12min(优选方案为10min)，最后用无菌水冲洗播种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上，25～28℃暗培养18～24天，然后转入光照培养6-8天，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导 将28-32天的实生苗节间茎段(上胚轴)切成长约1～1.5cm，不经过农杆菌浸染直接进行不定芽的诱导，以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂6-BA1～5mg·L-1(优选方案为3mg·L-1)进行培养，培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天10-14h；(3)外植体转化处理 农杆菌(携带目的基因)划线培养在含有100mg·L-1卡那霉素的YEB培养基上，26-30℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26-30℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD260＝0.8～1.0，然后以4500-5500r/min离心8-12min，除去上清液，再用悬浮液悬浮即可用于感染；将28-32天左右的实生苗上胚轴切成长约1～1.5cm，浸入到农杆菌悬浮液中18-22min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液；(4)抗性芽的诱导 将处理过的外植体接种在共培培养基(GM)MS+BA 3mg·L-1培养基上共培养2.5-3.5天后，转至筛选培养基(SX)MS+BA 1～5mg·L-1+Cef(头孢噻亏霉素)480-520mg·L-1+Km(卡那霉素)50～100mg·L-1+As(乙酰丁香酮)0～20mg·L-1进行选择培养，诱导抗性芽的产生。培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天10-14h；(5)不定芽微芽嫁接成苗卡里佐枳橙种子，先用70％的酒精浸泡30-45s，再用0.1％的升汞浸泡6min-8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MT固体培养基上，在26℃-28℃黑暗条件下恒温培养12-16天(黄化苗)，用作砧木；在无菌条件下，将培养的黄化苗切去根端部留4.5cm-5.5cm长，切去茎上部留1.6-2.4cm长，顶端劈口；接着，剥取抗性芽，基部斜切，插在砧木的劈口处，置于MS+10ml white有机物(25mg·L-1烟酸+25mg·L-1VB6+5mg·L-1VB1)+75g·L-1蔗糖+100mg·L-1肌醇)液体培养基中光照培养；(6)温室二次嫁接 待芽子长到1.6cm-2.4cm左右(微芽嫁接42-48天)，进行温室二次嫁接，二次嫁接以枳壳为砧木，采用劈接法，内套一塑料袋，用脱脂棉吸水置于袋内，以保持袋内湿度，外套一纸袋遮光，待成活后逐渐去除套袋。
可采用公知的PCR分析法进行抗性芽和抗性植株鉴定。微芽嫁接后的剩余抗性材料及温室抗性植株上取叶片用CTAB方法提取DNA，用各基因的专一引物nptII基因 5’-GAGGCTATTCGGCTATGACT-3’；5’-AATCTCGTGATGGCAGGTTG-3’rolA基因 5’-ATGGAATTAGCCGGA-3’；5’-ATCCCGTAGGTTTGT-3”rolB基因 5’-ATGGATCCCAAATTG-3’；5’-GGCTTCTTTCTTCAG-3’phyB基因 5’-CATTATCGGGCTACTGATATTCC-3’；5-TCCACTAgCTACATTGCTCCCA-3’；rolC基因 5’-ATGGCTGAAGACGACCTGTGT-3’；5’-GCCGATTGCAAACTTGCACTC3’；chit42基因5’-CTTCTGCAGCAAGCACCGAT-3’；5’-GGGGGGATCCTCCTCTAGTTGACCGCTTC-3’进行PCR分析，鉴定抗性芽和抗性植株。
携带目的基因之农杆菌及各基因的专一引物，上海生工生物工程公司可以提供。
本发明的优点是种子消毒效果好，几无污染；再生效率高，不定芽诱导率高达95％以上；共培培养基和筛选培养基能适合多品种和多种类型基因的遗传转化；再生转化植株没有嵌合现象。
具体实施例方式
下面结合优选实施例对本发明作进一步描述。
实施例1(1)种子消毒和萌发 将普通溆浦甜橙种子从果实中取出后，剥去外种皮和约2/3的内种皮，在70％酒精中浸泡30s，再在0.1％的升汞溶液中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4次，播种于1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上，25℃暗培养20天，然后转入光照培养7天，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导 将30天左右的实生苗节间茎段(上胚轴)切成长约1～1.5cm，不经过农杆菌浸染直接进行不定芽的诱导。以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂6-BA 1～5mg·L-1(优选方案为3mg·L-1)进行培养，培养温度27℃，光照强度1400lx，光照时间每天12h，两个星期后，上胚轴切段不定芽的诱导率达95％以上；(3)外植体转化处理 农杆菌(含载体质粒pDN3521，携带目的基因rolB基因)划线培养在含有100mg·L-1卡那霉素的YEB培养基上，28℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，28℃振荡培养22h，达到菌对数生长期，OD260＝0.8～1.0，然后5000r/min离心10min，除去上清液，再用悬浮液悬浮即可用于感染。将30天左右的实生苗上胚轴切成长约1～1.5cm，浸入到准备好农杆菌悬浮液中20min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液；(4)抗性芽的诱导将处理过的外植体接种在共培培养基(GM)MS+BA 3mg·L-1培养基上共培养3天后，转至筛选培养基(SX)MS+BA 3mg·L-1+Cef 500mg·L-1+Km 50mg·L-1+As20mg·L-1进行选择培养，诱导抗性芽的产生，培养温度27℃，光照强度1400lx，光照时间每天12h，15d，抗性芽诱导率达51％，芽的生长势强；(5)不定芽微芽嫁接成苗卡里佐枳橙种子，先用70％的酒精浸泡30s，再用0.1％的升汞浸泡7min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MT固体培养基上，在27℃黑暗条件下恒温培养14天(黄化苗)，用作砧木；在无菌条件下，将培养的黄化苗切去根端部留约5.0cm长，切去茎上部留约2.0cm长，顶端劈口；接着，剥取抗性芽，基部斜切，插在砧木的劈口处；置于MS+10ml white有机物(25mg·L-1烟酸+25mg·L-1VB6+5mg·L-1VB1)+75g·L-1蔗糖+100mg·L-1肌醇)液体培养基中光照培养；(6)温室二次嫁接待芽子长到2cm左右(微芽嫁接45天)，进行温室二次嫁接，二次嫁接以枳壳为砧木，采用劈接法，内套一塑料袋，用脱脂棉吸水置于袋内，以保持袋内湿度，外套一纸袋遮光，待成活后逐渐去除套袋，嫁接成活率达到100％。
微芽嫁接后的剩余抗性材料用CTAB方法提取DNA，用rolB特有引物进行PCR分析。结果表明，rolB已导入到甜橙基因组中。目前，已有2株大红甜橙的转rolB基因植株在温室内生长良好。再生转化植株没有嵌合现象。
实施例2(1)取柠檬种子，消毒和萌发方法同实施例1(1)，(2)～(6)农杆菌带pBin19质粒，T-DNA携带chit42基因、选择基因nptII。共培培养基(GM)为MS+BA3mg·L-1，筛选培养基MS+BA 3mg/L+Cef(头孢噻亏霉素)500mg·L-1+Km 100mg·L-1。其它同实施例1(2)～(6)。
采用公知的nptII和chit42基因的特异引物进行分析，从350个转化的外植体中获得了5个转化芽，获得3个转化系，通过繁殖，共获得100株转基因苗。再生转化植株没有嵌合现象。
实施例3(1)取普通溆浦甜橙种子，消毒和萌发方法同实施例1(1)，(2)～(6)农杆菌带pBvin19质粒，T-DNA携带chit42基因、选择基因nptII。共培培养基(GM)MS+BA3mg·L-1，筛选培养基MS+BA 3mg/L+Cef300mg·L-1+Km 50mg·L-1，其它同实施例1(2)～(6)。
从抗性芽和抗性植株上取叶片提取DNA，进行PCR分析，用chit42的特异引物进行PCR扩增，获得3个转化系，43个转化植株。转化植株没有嵌合现象。
实施例4(1)取枳橙种子，实施方式同实施例1(1)。(2)～(6)根癌农杆菌C58C1含质粒pDN3514，T-DNA携带rolA、B、C基因、报告基因GUS、选择基因nptII，共培培养基(GM)和筛选培养基同实施例3，其它实施方式同实施例1(2)～(6)。(7)用rolA、B、C特有引物进行PCR分析。结果表明，rolA、B、C已导入到枳橙基因组中，已获得5个转化系。经过快繁，目前已得转化系苗共500株。转化植株没有嵌合现象。
实施例5(1)取枳橙种子，消毒和萌发方法同实施例1(1)；(2)～(6)农杆菌带pGV3850质粒，含有CaMN35S启动子启动的phyB基因，筛选标记基因NPTII基因，其它同实施例1(2)～(6)。
从不定芽上提取DNA进行PCR检测分析，获得三个转化系PhyB1，PhyB2，PhyB3，三个转基因系已繁育出15株苗，在温室生长良好，没有嵌合现象。
实施例6(1)取普通溆浦甜橙种子，消毒和萌发方法同实施例1(1)；(2)～(6)农杆菌带pGV3850质粒，含有CaMN35S启动子启动的phyB基因，筛选标记基因NPTII基因。其它同实施例1(2)～(6)。从不定芽上提取DNA进行PCR检测分析。获得3个转基因系，共20株转化植株，在温室生长良好。
权利要求
1.一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)种子消毒和萌发将普通溆浦甜橙或大红甜橙或柚或柠檬或枳橙种子从果实中取出后，剥去外种皮和约2/3的内种皮，在70％酒精中浸泡28-32s，0.1％的升汞溶液中浸泡8～12min，最后用无菌水冲洗3～4次，播种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上，25～28℃暗培养18～24天，然后转入光照培养6-8天，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导将28-32天的实生苗节间茎段上胚轴切成长约1～1.5cm，不经过农杆菌浸染直接进行不定芽的诱导，以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂6-BA 1～5mg·L-1进行培养，培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天10-14h；(3)外植体转化处理将携带目的基因之农杆菌划线培养在含有100mg·L-1卡那霉素的YEB培养基上，26-30℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26-30℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD260＝0.8～1.0，然后以4500-5500r/min离心8-12min，除去上清液，再用悬浮液悬浮即可用于感染；将28-32天左右的实生苗上胚轴切成长约1～1.5cm，浸入到农杆菌悬浮液中18-22min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液；(4)抗性芽的诱导将处理过的外植体接种在共培培养基MS+BA 3mg·L-1培养基上共培养2.5-3.5天后，转至筛选培养基MS+BA 1～5mg·L-1+Cef480-520mg·L-1+Km 50～100mg·L-1As0～20mg·L-1进行选择培养，诱导抗性芽的产生。培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天12-14h；(5)不定芽微芽嫁接成苗卡里佐枳橙种子，先用70％的酒精浸泡30-45s，再用0.1％的升汞浸泡6min-8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MT固体培养基上，在26℃-28℃黑暗条件下恒温培养12-16天(黄化苗)，用作砧木；在无菌条件下，将培养的黄化苗切去根端部留4.5cm-5.5cm长，切去茎上部留1.6-2.4cm长，顶端劈口；接着，剥取抗性芽，基部斜切，插在砧木的劈口处，置于MS+10ml white有机物(25mg·L-1烟酸+25mg·L-1VB6+5mg·L-1VB1)+75g·L-1蔗糖+100mg·L-1肌醇)液体培养基中光照培养；(6)温室二次嫁接待芽子长到1.6cm-2.4cm，进行温室二次嫁接，二次嫁接以枳壳为砧木，采用劈接法，内套一塑料袋，用脱脂棉吸水置于袋内，以保持袋内湿度，外套一纸袋遮光，待成活后逐渐去除套袋。
2.根据权利要求1所述的柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法，其特征在于，所述种子在0.1％的升汞溶液中浸泡的时间为10min。
3.根据权利要求1或2所述的柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法，其特征在于，所述外加生长调节剂6-BA的加入量为3mg·L-1。
全文摘要
本发明公开了一种柑橘再生和遗传转化的方法，其包括如下步骤(1)种子消毒和萌发，进行将种子在酒精、升汞溶液中浸泡消毒后，再用无菌水冲洗，然后播种于培养基上培养，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导，以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂进行培养；(3)外植体转化处理，用农杆菌(携带目的基因)浸染无菌苗节间茎段(上胚轴)；(4)抗性芽的诱导；(5)不定芽微芽嫁接成苗；(6)温室二次嫁接。本发明的优点是种子消毒效果好，几乎无污染；再生效率高，不定芽诱导率高达95％；共培培养基和筛选培养基能适合多品种和多种类型基因的遗传转化。
文档编号A01H3/04GK1833488SQ20051003244
公开日2006年9月20日 申请日期2005年11月28日 优先权日2005年11月28日
发明者邓子牛, 谢玉明, 敖小平, 郭琛, 焦徕, 胡春华 申请人:邓子牛, 谢玉明, 胡春华