一种长叶点地梅组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种长叶点地梅组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002]长叶点地梅(Jfli/msace 1ngifolia)是报春花科点地梅属的一种草本植物，其植株矮小、单朵花虽小，但花色清新，具有较好的耐践踏性是，是一种难得的早春花卉，具有很高的观赏价值。长叶点地梅还具较高的药用价值，其富含黄酮类、三萜类化合物，具有抑制癌细胞增长的药理作用。
[0003]目前，长叶点地梅具有观赏和药用双重功能，但对其的相关研究鲜有报道，其一直处于野生状态。随着我国的自然生态环境逐渐遭到破坏甚至恶化，生长在野外的长叶点地梅资源也受到了不同程度的破坏，因此急需建立长叶点地梅离体快繁技术体系，以达到保存其种质资源的目的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种长叶点地梅组织培养快繁方法，本发明以长叶点地梅种子为外植体，经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立长叶点地梅组织培养快繁体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种长叶点地梅组织培养快繁方法，包括以下的步骤:
(I)种子萌发:将野外采集的野生长叶点地梅种子先用洗衣粉水冲洗I?3h，然后于超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次,再用I?5%次氯酸钠溶液消毒10?25min，用无菌水冲洗4?6次后放于无菌培养皿(培养皿底层铺一层薄的脱脂棉，再在脱脂棉上覆盖滤纸后灭菌)的滤纸上，加入适量无菌水，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001x，直至种子萌发，期间定期向培养皿中加入适量无菌水，以保证脱脂棉和滤纸湿润。
[0006](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)得到的刚萌发的高约Icm的实生苗下胚轴切下并接种到诱导培养基上，先在25?28°C条件下全暗培养30?45天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001x，直至诱导形成胚性愈伤组织。
[0007](3)分化培养:将步骤(2)培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织切成0.5cm3大小的小块转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为3000?50001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽。
[0008](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为2.5?3.5cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养至生根。
[0009](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约6?8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土:沙土 = 2:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田。
[0010]上述步骤(2 )所述的诱导培养基为:MS+0.1?0.6mg/L6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3 )所述的分化培养基为:MS+0.0I?0.lmg/LTDZ+0.1?0.5mg/LKT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的生根培养基为:MS+1?5mg/L IBA+15?30g/L蔗糖+3.5?
6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]与现有技术相比本发明的优点是:本发明通过无性快繁技术快速获得大量种苗的方法。以长叶点地梅种子为外植体，经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立长叶点地梅组织培养快繁体系，为今后通过多倍体育种、转基因等方法培育出花大、色艳、观赏价值高的长叶点地梅新品种提供参考。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1:
(O种子萌发:将野外采集的野生长叶点地梅种子先用洗衣粉水冲洗lh，然后于超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用2%次氯酸钠溶液消毒lOmin，用无菌水冲洗4次后放于无菌培养皿(培养皿底层铺一层薄的脱脂棉，再在脱脂棉上覆盖滤纸后灭菌)的滤纸上，加入适量无菌水，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x，直至种子萌发，期间定期向培养皿中加入适量无菌水，以保证脱脂棉和滤纸湿润，种子萌发率可达95%以上。
[0016](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)得到的刚萌发的高约Icm的实生苗下胚轴切下并接种到诱导培养基上，先在28°C条件下全暗培养35天，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x的条件下培养10天即可形成胚性愈伤组织，诱导率达88.9%。所述的诱导培养基为 MS+0.3mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0017](3)分化培养:将步骤(2)培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织切成0.5cm3大小的小块转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为30001x，置于培养温度为28°C的条件下培养培养14天即可形成不定芽。所述的分化培养基为MS+0.05mg/LTDZ+0.lmg/L KT+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH 为 5.8。
[0018](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为2.5?3.5cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为20001x，培养温度为28°C的条件下培养18天即可生根，生根率达87.9%。所述的生根培养基为MS+lmg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
[0019](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约6?8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土:沙土 = 2:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可达90%以上。
[0020]实施例2:
(O种子萌发:将野外采集的野生长叶点地梅种子先用洗衣粉水冲洗2h，然后于超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒8s后用无菌水洗3次，再用4%次氯酸钠溶液消毒lOmin，用无菌水冲洗4次后放于无菌培养皿(培养皿底层铺一层薄的脱脂棉，再在脱脂棉上覆盖滤纸后灭菌)的滤纸上，加入适量无菌水，然后置于每天光照11小时，光照强度为15001x，直至种子萌发，期间定期向培养皿中加入适量无菌水，以保证脱脂棉和滤纸湿润，种子萌发率可达91%以上。
[0021](2)愈伤组织诱导:将步骤(I)得到的刚萌发的高约Icm的实生苗下胚轴切下并接种到诱导培养基上，先在28°C条件下全暗培养35天，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x的条件下培养10天即可形成胚性愈伤组织，诱导率达81%。所述的诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+15g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0022](3)分化培养:将步骤(2)培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织切成0.5cm3大小的小块转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为30001x，置于培养温度为28°C的条件下培养培养14天即可形成不定芽。所述的分化培养基为MS+0.lmg/LTDZ+0.3mg/L KT+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为 5.8。
[0023](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为2.5?3.5cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养7天，然后置于每天光照14小时，光照强度为20001x，培养温度为28°C的条件下培养18天即可生根，生根率达90%。所述的生根培养基为MS+3mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。
[0024](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约6?8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土:沙土 = 2:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率可达85%以上。
【主权项】
1.一种长叶点地梅组织培养快繁方法，其特征在于包括以下步骤: (1)种子萌发:将野外采集的野生长叶点地梅种子先用洗衣粉水冲洗I?3h，然后于超净工作台中，剥开外种皮，先用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次,再用I?5%次氯酸钠溶液消毒10?25min，用无菌水冲洗4?6次后放于无菌培养皿，培养皿底层铺一层薄的脱脂棉，再在脱脂棉上覆盖滤纸后灭菌的滤纸上，加入适量无菌水，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001x，直至种子萌发，期间定期向培养皿中加入适量无菌水，以保证脱脂棉和滤纸湿润； (2)愈伤组织诱导:将步骤(I)得到的刚萌发的高约Icm的实生苗下胚轴切下并接种到诱导培养基上，先在25?28°C条件下全暗培养30?45天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001χ，直至诱导形成胚性愈伤组织； (3)分化培养:将步骤(2)培养获得的呈绿色的子叶愈伤组织切成0.5cm3大小的小块转入分化培养基上进行分化培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照12?16小时，光照强度为3000?50001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养直至形成不定芽； (4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为2.5?3.5cm的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养7?14天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养至生根； (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约6?8cm的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土:沙土= 2:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量兀素营养液给幼苗烧水,保持湿度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根据权利要求1所述的一种长叶点地梅组织培养快繁方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.1 ?0.6mg/L6-BA+0.1 ?0.5mg/L NAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种长叶点地梅组织培养快繁方法，其特征在于步骤(3)所述的分化培养基为:MS+0.01 ?0.lmg/LTDZ+0.1 ?0.5mg/L KT+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种长叶点地梅组织培养快繁方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养基为:MS+1?5mg/L IBA+15?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L琼脂,pH为5.4?5.8。
【专利摘要】本发明公开了一种长叶点地梅组织培养快繁方法，涉及长叶点地梅（Androsace longifolia）通过无性快繁技术快速获得大量种苗的方法。本发明以长叶点地梅种子为外植体，经过愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立长叶点地梅组织培养快繁体系，为今后通过多倍体育种、转基因等方法培育出花大、色艳、观赏价值高的长叶点地梅新品种提供参考。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104686334
【申请号】CN201510085924
【发明人】刘木娇
【申请人】刘木娇
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月22日