一种大岩桐离体再生体系建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及园艺植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种大岩桐离体再生体系建立方法。
【背景技术】
[0002]大岩桐(■spec1sa)又名六雪尼、落雪泥、巴西芙蓉等,是苦苣苔科岩桐属多年生球根草本花卉，块茎扁球形，叶对生，肥厚而大，密生茸毛，花朵钟状，色彩丰富，大而美丽，是国庆用花的理想品种。大岩桐的栽培品种繁多，花色有蓝、粉红、白、红、紫等，还有白边监花，白边红花双色和重辦花。常见品种有威廉皇帝、挑战、火神等，世界各地均有栽培。大岩桐喜温暖、不耐低温，5°C以下难以越冬，培育抗寒品种有望实现非温室越冬，扩大种植面积，降低生产成本。
[0003]目前，大岩桐种苗主要是通过种子、球根萌发、扦插等方式进行繁育。种种方式都有各自特色，主要缺点是繁殖系数低，这很大程度上影响了其规模化发展和市场化的要求。而植物组织培养技术具有加速育种进程、缩短繁殖时间、改良植物品质、节省空间、减少劳动、可终年生产、不受自然条件限制等特点，可有效解决大岩桐种苗繁殖耗时长、繁殖系数低的问题。因此，建立大岩桐离体再生技术体系，对推动优良大岩桐园艺品种在我国的生产及应用具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种大岩桐离体再生体系建立方法，本发明以大岩桐幼嫩叶片为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了一种大岩桐离体再生体系建立方法，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种大岩桐离体再生体系建立方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒:从盒栽的生长旺盛的大岩桐植株上的幼嫩叶片为外植体，先用流水下冲洗I?3h后置于超净工作台中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0006](2)芽诱导培养:将步骤(I)处理后的叶片切成I X Icm2长的小块并接种到诱导培养基上，先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001x，直至诱导形成不定芽。
[0007](3)增殖培养:将步骤(2)培养的叶片边缘伤口处产生的愈伤组织上的不定芽长至约2.0?3.0cm时切下，剪掉其茎尖并接种至增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?5天，然后置于每天光照10?13小时，光照强度为1500?25001x,置于培养温度为25?28°C的条件下培养2?3周后，其叶腋处就会长出许多小芽，再将这些小芽反复切割进行继代培养，以得到更多的不定芽。
[0008](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5?4.5cm的小芽分切下并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养20天左右即开始生根。
[0009](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5?7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3?5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵溶液中浸泡8?10s，栽入由营养土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60%?80%的遮阴处理。
[0010]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.5?2mg/L6-BA+0.1?lmg/L NAA+15?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L6-BA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]与现有技术相比本发明的优点是:本发明通过植物组织培养方法短时间内获得大量优质大岩桐种苗的方法。以大岩桐幼嫩叶片为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了一种大岩桐离体再生体系建立方法，为满足对大岩桐优质种苗的需求、加速大岩桐良种的推广具有重要的现实意义。。
【具体实施方式】
[0014]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0015]实施例1:
(I)外植体消毒:从盒栽的生长旺盛的大岩桐植株上的幼嫩叶片为外植体，先用流水下冲洗Ih后置于超净工作台中，再于用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0016](2)芽诱导培养:将步骤(I)处理后的叶片切成I X Icm2长的小块并接种到诱导培养基上，先在28°C条件下全暗培养I天，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x条件培养30天即可诱导形成不定芽，诱导率为96%。所述的诱导培养基为MS+0.Smg/L6-BA+0.3mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0017](3)增殖培养:将步骤(2)培养的叶片边缘伤口处产生的愈伤组织上的不定芽长至约2.0?3.0cm时切下，剪掉其茎尖并接种至增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照10小时，光照强度为15001x，置于培养温度为28°C的条件下培养14天后，其叶腋处就会长出许多小芽，再将这些小芽反复切割进行继代培养，以得到更多的不定芽。所述的增殖培养基为MS+0.5mg/L NAA+lmg/L 6_BA+30g/L蔗糖+6.0g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0018](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5?4.5cm的小芽分切下并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为28°C的条件下培养18天即开始生根，生根率
100% ο
[0019](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5?7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵溶液中浸泡8s，栽入由营养土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60%的遮阴处理，移栽成活率为98%以上。所述的生根培养基为1/2MS+0.5mg/L NAA+15g/L鹿糖+3.5?g/L琼脂，pH为5.8。
[0020]实施例2:
(I)外植体消毒:从盒栽的生长旺盛的大岩桐植株上的幼嫩叶片为外植体，先用流水下冲洗Ih后置于超净工作台中，再于用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次,再用0.1%升汞溶液消毒lmin，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0021](2)芽诱导培养:将步骤(I)处理后的叶片切成IXlcm2长的小块并接种到诱导培养基上，先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照11小时，光照强度为15001x条件培养28天即可诱导形成不定芽，诱导率为92%。所述的诱导培养基为MS+lmg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0022](3)增殖培养:将步骤(2)培养的叶片边缘伤口处产生的愈伤组织上的不定芽长至约2.0?3.0cm时切下，剪掉其茎尖并接种至增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在28°C条件下全暗培养5天，然后置于每天光照11小时，光照强度为20001χ，置于培养温度为28°C的条件下培养15天后，其叶腋处就会长出许多小芽，再将这些小芽反复切割进行继代培养，以得到更多的不定芽。所述的增殖培养基为MS+0.3mg/L NAA+0.9mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。
[0023](4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5?4.5cm的小芽分切下并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为15001x，培养温度为28°C的条件下培养18天即开始生根，生根率100%。所述的生根培养基为1/2MS+0.8mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5?g/L琼脂，pH为5.8。
[0024](5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5?7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵溶液中浸泡8s，栽入由营养土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60%的遮阴处理，移栽成活率为96%以上。
【主权项】
1.一种大岩桐离体再生体系建立方法，其特征在于包括以下步骤: (1)外植体消毒:从盒栽的生长旺盛的大岩桐植株上的幼嫩叶片为外植体，先用流水下冲洗I?3h后置于超净工作台中，再于用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒I?1min,用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用; (2)芽诱导培养:将步骤(I)处理后的叶片切成IX Icm2长的小块并接种到诱导培养基上，先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?30001x，直至诱导形成不定芽； (3)增殖培养:将步骤(2)培养的叶片边缘伤口处产生的愈伤组织上的不定芽长至约2.0?3.0cm时切下，剪掉其茎尖并接种至增殖培养基上进行增殖培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?5天，然后置于每天光照10?13小时，光照强度为1500?25001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养2?3周后，其叶腋处就会长出许多小芽，再将这些小芽反复切割进行继代培养，得到不定芽； (4)生根培养:将步骤(3)过程获得的高度约为3.5?4.5cm的小芽分切下并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养3?7天，然后置于每天光照12?15小时，光照强度为1500?25001x，培养温度为25?28°C的条件下培养20天左右即开始生根； (5)炼苗移栽:将步骤(4)获得的高约5?7cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗3?5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基并在多菌灵溶液中浸泡8?10s，栽入由营养土:沙土 = 3:1混合成的基质，保持湿度并给予60%?80%的遮阴处理。
2.根据权利要求1所述的一种大岩桐离体再生体系建立方法，其特征在于步骤(2)所述的诱导培养基为:MS+0.5 ?2mg/L6_BA+0.1 ?lmg/L NAA+15 ?30g/L 鹿糖+3.5 ?6.0g/L琼脂，pH为5.4?5.8。
3.根据权利要求1所述的一种大岩桐离体再生体系建立方法，其特征在于步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1?lmg/L ΝΑΑ+0.5?lmg/L 6-BA+15?30g/L鹿糖+3.5?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
4.根据权利要求1所述的一种大岩桐离体再生体系建立方法，其特征在于步骤(4)所述的生根培养基为:l/2MS+0.1?2mg/L NAA+15?30g/L蔗糖+3.5?6.0g/L琼脂，pH为5.4 ?5.8。
【专利摘要】本发明公开了一种大岩桐离体再生体系建立方法，涉及大岩桐（Sinningia speciosa）通过植物组织培养方法短时间内获得大量优质大岩桐种苗的方法。本发明以大岩桐幼嫩叶片为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了一种大岩桐离体再生体系建立方法，为满足对大岩桐优质种苗的需求、加速大岩桐良种的推广具有重要的现实意义。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104686328
【申请号】CN201510085884
【发明人】杨业云
【申请人】杨业云
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月21日