专利名称：超雄鱼繁育体系的建立技术的制作方法
技术领域：
本发明公开了一类超雄鱼繁育体系的建立技术。它属于鱼类性别控制技术领域。
建立超雄鱼(YY，♂)繁育体系是在渔业生产上推广养殖全雄鱼(YY，♂)的先决条件，在本发明提出之前，世界各国的水产科技工作者采用雄核发育的技术途径获得超雄鱼(YY，♂)，然后与普遍的雌鱼(XX，♀)交配，产生出全雄鱼(XY，♂)后代。杨永铨(1980)曾提出三系配套繁育全雄罗非鱼的技术途径，但由于具有YY染色体的超雄鱼的检测很困难，难以在生产上实施，而雄核发育的技术途径，也因超雄鱼各个基因座位高度纯合、理化方法处理雄核发育卵子第一次有丝分裂使染色体加倍时，染色体组受到严重的损伤，以及理化方法使卵核失活的同时，也使卵细胞质的线粒体DNA受损，导致雄核发育的后代存活率很低，从鱼苗孵化至开口摄食的存活率在1％至5％左右，而从摄食期至性成熟的存活率尚无确切的报道。
国内外水产科技工作者采用雄核发育技术或其它方法，获得过川鲽(Platichthys flesus)、欧洲泥鳅(Misgurnus fossilis)、鲑鳟鱼类、红鲤、团头鲂和草鱼、斑马鱼、尼罗罗非鱼、鳗尾泥鳅、虹鳟等的雄核发育单倍体胚胎或幼鱼，少数种类养成性成熟的超雄鱼(YY，♂)，但由于超雄鱼存活率极低，至今，尚未见到建立超雄鱼繁育体系的报道，因而未能在渔业生产上利用超雄鱼产生全雄性后代。
本发明的发明目的是为克服上述的鱼类雄核发育技术存在的问题，避免或减少目前人工雄核发育产生超雄鱼技术的种种弊端，采取全新的技术路线，大大提高雄核发育二倍体的孵化率、存活率与生命力，并将一部分超雄鱼性转化为生理“雌鱼”(YY，♀)，然后通过超雄鱼(YY，♀)与生理“雌鱼”(YY，♀)交配，生产出大量的超雄鱼(YY，♂)后代，在渔业生产上应用超雄鱼与普通雌鱼(XX，♀)交配，获得大批量的全雄鱼(XY，♂)。
为实现本发明的目的所采取的技术措施是超雄鱼繁育体系的技术路线包括如下3个步骤1.人工雄核发育二倍体的获得(1)用适当浓度的细胞分裂阻断剂对性成熟的雄鱼进行腹腔注射，获得不减数的二倍体精子(XX，♂；YY，♂)。
(2)用适当浓度的细胞分裂阻断剂对性成熟的杂种雄鱼进行腹腔注射，获得不减数的异源二倍体精子(XX，♂，YY，♂)。
(3)用适当剂量的γ-射线、紫外线或x-射线照射同种鱼性成熟的雌鱼卵子，使卵核完全失活。
(4)将二倍体精子与卵核失活的卵子进行人工授精，然后在恒温孵育箱中孵化出鱼苗，雄性个体便是人工雄核发育的超雄鱼(YY，♂)。
(5)或将(4)的受精卵发育至囊胚期的囊胚细胞用电融合或核移植技术，将囊胚细胞核注入同种鱼成熟的未受精卵中，然后置恒温孵育箱中孵化出鱼苗，其中的雄性个体便是人工雄核发育的超雄鱼(YY，♂)。
2.生理“雌鱼”(YY，♂)的获得将一部分超雄鱼鱼苗在开口摄食后的适当日龄时，用拌有雌激素的人工饲料喂食适当的时日，其中的雌性个体便是性转化的生理“雌鱼”，其基因型仍然是YY，♀。
3.全部为超雄鱼后代的获得将1、2获得的超雄鱼(YY，♂)与生理“雌鱼”(YY，♀)进行人工授精，或人工催情自然产卵，便可获得100％超雄鱼后代。
通过1、2、3，三个主要步骤，建立一个超雄鱼繁育体系，便可在渔业生产上利用超雄鱼与普通雌鱼(XX，♀)交配，生产出100％的全雄鱼(XY，♂)，达到降低成本，提高效益的目的。
本发明的创新点是(1)采用活体注射适当浓度的纺锤丝阻断剂，产生不减数二倍体精子，与卵核失活的卵子受精，不需再经染色体加倍处理，直接发育成超雄鱼(YY，♂)；(2)采用活体注射适当浓度的纺锤丝阻断剂，产生不减数的异源二倍体配子，雌、雄配子受精后获得异源四倍体后代，然后用异源二倍体精子与卵核失活的卵子受精，不需再经染色体加倍处理，直接发育成异源超雄性(YY，♂)；(3)采用电融合或细胞核移值技术，将二倍体雄核发育的囊胚细胞核注射至成熟的未受精卵中，孵育出正常的超雄性(YY，♂)。
与已有技术相比较，本发明采用新的技术途径获得超雄鱼的优点是(1)采用活体注射细胞分裂阻断剂体内加倍方法，产生二倍体精子，与目前一般采取理、化方法阻断雄核发育单倍体第一次有丝分裂，使染色体加倍，产生二倍体超雄鱼的技术相比较，本发明的技术途径对卵子较少损伤，从而提高孵化率与鱼苗的存活率；(2)采用活体注射细胞分裂阻断剂体内加倍方法，产生异源二倍体精子，提高了二倍体精子基因座位的杂合性，从根本上提高雄核发育的孵化率、鱼苗的存活率和超雄鱼的生命力，大大增加超雄鱼的获得率；
(3)采用电融合或细胞核移植技术，将雄核发育二倍体囊胚细胞核注入成熟的未受精卵，孵出正常的超雄鱼，避免了卵细胞质线粒体损伤对胚胎及其后代的长远影响，从而提高雄核发育的孵化率、存活率与生命力，增加超雄鱼的获得率；(4)采用活体注射细胞分裂阻断剂体内加倍方法，有可能产生二倍体不减数的配子，受精后获得同源或异源四倍体后代，如果四倍体是能育的，则可获得一个人工合成的四倍体新种系，与普通二倍体交配，产生三倍体不育鱼，形成一个新的四倍体——三倍体繁育体系，在生产上养殖三倍体不育鱼。
本专利技术基本上适用于任何一种卵生的鱼类超雄鱼及其繁育体系的开发。
实施例泥鳅(Misgurnus anguilicaudatus)超雄鱼繁育体系。
已知泥鳅的性染色体为雌鱼(♀，XX)，雄鱼(♂，XY)1.选择性成熟的雄性泥鳅在18～24℃水温条件下，每条按常规方法注射HCG2001.U.后4～6小时内，腹腔注射0.2％秋水仙素0.2～0.4ml，并于2～4小时后挤出成熟的不减数的二倍体精子(XX，♂，XY，♂)，备用。
2.选择性成熟(IV期中)的雌性泥鳅，在18～24℃水温条件下，每条鱼注射HCG4001.U.后，并于10～12小时后挤出成熟的未受精卵。
3.将(2)获得未受精卵置人工合成卵巢液中用100～130mJ/cm2的紫外线辐照处理，使卵核失活，备用。
4.将(1)所得不减数的二倍体精子与(3)所得的核失活未受精卵进行人工授精，受精卵置24℃恒温箱中，孵出鱼苗，然后按常规养成性成熟个体，其中存活的雄性个体便是人工雄核发育的超雄鱼(YY，♂)。
5.将(4)所得的部份鱼苗，在开口摄食的5～7天后，用拌有雌二醇的人工饲料(60mg/kg)喂养6～8周，其中的雌性个体便是性转化的生理“雌鱼”，其基因型仍然是YY，♀。
6.将(4)所得超雄鱼(YY，♂)与(5)所得的生理“雌鱼”(YY，♀)进行人工授精，便可获得100％超雄鱼后代(YY，♂)。
通过以上步骤，建立起泥鳅超雄鱼繁育体系。
权利要求
1.一类超雄鱼繁育体系的建立技术，其特征在于选择性成熟的雄鱼按常规方法注射催产激素后，采用活体注射一定浓度细胞分裂阻断剂，产生不减数同源二倍体精子；同时，按同样处理获得不减数异源二倍体精子；另将成熟的未受精卵经射线处理成卵核失活卵子，将不减数同源或异源二倍体精子与卵核失活卵子受精后获得雄核发育囊胚期胚胎，再采用电融合或细胞核移值技术，将二倍体雄核发育的囊胚细胞核注射至成熟的未受精卵中，孵育出正常的超雄鱼鱼苗，将一部分超雄鱼鱼苗，经激素处理性转化成生理雌鱼，最后，由超雄鱼与生理雌鱼交配，产生100％超雄鱼后代。由此，建立起超雄鱼繁育体系。
2.根据权利要求1所述的超雄鱼繁育体系的建立技术，其特征在于超雄鱼繁育的具体繁育控制条件如下(1)选择性成熟的雄鱼按常规方法注射催产激素后6～10小时内，腹腔注射0.2％秋水仙素0.1～0.6ml或0.01％的细胞松驰素-B0.1～0.6ml，并于4～8小时后挤出成熟的不减数的二倍体精子即XX，♂；YY，♂，备用；(2)按(1)方法对性成熟的杂种雄鱼进行腹腔注射，获得不减数的异源二倍体精子即XX♂，YY♂，备用；(3)选择IV期中性成熟的雌鱼，在20～28℃水温条件下，按常规注射催产激素，获得未受精卵，然后在人工合成卵巢液中用15000～25000rad的γ-射线或7500～12000rad x-射线或100～250mJ/cm2的紫外线辐照处理，使卵核失活，备用。(4)用(1)、(2)不减数的二倍体精子与(3)卵核失活的未受精卵，按常规进行人工授精，受精卵置22～28℃恒温箱孵育出鱼苗，然后按常规养成性成熟的个体，其中雄体个体便是人工雄核发育的超雄鱼即YY，♂；(5)或将(4)的受精卵发育至囊胚期的囊胚细胞按常规用电融合或核移植技术，将囊胚细胞核注入同种鱼的成熟未受精卵中，然后置22～28℃恒温箱中孵出鱼苗后养成性成熟的个体，其中雄性个性便是人工雄核发育的超雄鱼即YY，♂；(6)将(4)、(5)所得的部分鱼苗，在开口摄食的一周内，用拌有为含量25～120mg/kg雌二醇或含量为25～200mg/kg苯甲基雌二醇的饲料喂养6～8周，然后按常规养成性成熟的雌鱼，便是性转化的生理“雌鱼”即YY，♀；(7)将(4)、(5)所得的超雄鱼与(6)所得的生理“雌鱼”即YY，♀，进行人工授精，便可获得100％超雄鱼后代即YY，♂，由此建立起超雄鱼繁育体系。
全文摘要
本发明公开了超雄鱼繁育体系的建立技术,采用活体注射一定浓度的阻断剂,产生不减数同源或异源二倍体精子;将同源或异源二倍体精子与卵核失活卵子受精后的雄核发育囊胚细胞核注射至成熟未受精卵中,直接发育成同源或异源超雄鱼鱼苗,将一部分超雄鱼苗性转化成生理“雌鱼”,最后,由超雄鱼与生理“雌鱼”交配,孵育出正常的100%超雄鱼后代。本发明对人工培育新鱼种、渔业规模生产养殖全雄鱼、保护种质资源具有巨大作用。
文档编号A01K61/00GK1340298SQ0011597
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月25日 优先权日2000年8月25日
发明者陈宏溪, 崔书勤, 郭海 申请人:武汉康祥科技发展有限公司