专利名称：一种金线莲共生苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种金线莲组培苗与菌根真菌共生得到金线莲共生苗的方法。
背景技术：
金线莲属于兰科开唇兰属的多年生草本植物，是民间使用较广的一种传统珍贵药 材，多用于治疗肺结核、肺热咳嗽、风湿性关节炎等。近几年来，金线莲用于治疗高血压、糖 尿病及肿瘤等疑难病症所取得的成效，日益引起医药界的重视，特别在台湾，金线莲有“中 药之王”之称。然而，金线莲在自然界资源非常稀少，其中原因除了它对生态环境的要求非常苛 刻及受自然界小动物和人们的破坏外，更主要的是，金线莲的种子非常小，没有完整的胚供 其发育，在自然条件下，需要内生真菌的侵染为其提供营养才能发育成苗，这也是兰科植物 一个普遍的特征。内生真菌除了可为金线莲等兰科植物提供营养物质外，还可以促进其对 矿物质的吸收，产生植物生长发育所需维生素及植物激素类物质，增强植物抗逆性及抗病 力(参考周德平等发表在《上海农业学报》第2005. 21 (3)期《兰科植物内生真菌的功能及 应用前景[J]》)。由此可见，采用金线莲组培苗与菌根真菌共生的方法，有着可促进植物生 长、增强植物抗逆性及抗病力等优点，可以克服目前组培苗生长缓慢、抗逆性弱、死亡率高 等一些缺点。目前，已报道的兰科植物共生方法通常是采用单株苗进行共生培养(参考于 雪梅、郭顺星发表在《中国中药杂志》第2000. 25(2)期《金线莲与内生真菌共生培养体系 的建立》；袁莉杭等发表在《微生物学杂志》第2008. 28 (1)《春兰菌根菌的分离及共生培养 体系的研究》)。采用组培苗全苗与菌根真菌共生，由于细胞天然的结构屏障，导致侵入频 率较低，且生产效率低下。而采用组培苗茎节与菌根真菌进行共生培养的方法，通过损伤打 破细胞屏障，使菌根真菌顺利的通过伤口侵入金线莲茎节表层细胞，大大提高侵染频率，同 时，该法还大大减少的组培苗的使用量，可提高生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种金线莲组培苗与菌根真菌共生得到金线莲共生苗的 方法。本发明所述的方法包含如下步骤1).以丝核菌(Rhizoctonia spp.)作为内生真菌进行培养并制作菌丝琼脂块；2).金线莲组培共生将无菌金线莲组培苗去掉顶部叶芽，分成上下两个茎段，然 后与丝核菌(Rhizoctonia spp.)菌丝琼脂块同时接到共生培养基中培养。其中，所述金线莲组培共生的培养条件为在纯培养条件下20 25°C培养，光照 强度为500 25001x，每天10 13小时，培养2 3个月。所述金线莲组培苗的每个茎段上至少具有一个以上的茎节。所述的丝核菌(Rhizoctonia spp.)为由野生金线莲根部分离所得到的、保藏在中 国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心、保藏编号为CGMCC N0. 3074、保藏日期为2009
3年 5 月 20 日的丝核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1。采用本发明所述的茎段共生式金线莲组培共生培育方法，可以大大降低使用金线 莲组培苗的成本，缩短生长周期，提高存活率，从而降低其生产成本，有利于实现产业化生产。
图1为丝核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1在PDA培养基上培养两天的菌落形态；图2为丝核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1在PDA培养基上培养7天的菌核形态；图3为丝核菌(Rhizoctonia sp. ) JSH-1个体形态及番红0-K0H细胞核染色， 400 X ；图4为接菌金线莲茎段生长状况；图5为不接菌金线莲茎段生长状况。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图对本发明进一步说明。具体实施例先将丝核菌(Rhizoctonia sp. ) JSH-1从低温保藏的斜面试管菌种活化后，转入 PDA平板，28 °C黑暗培养3 5天备用。用已灭菌的打孔器(直径为0. 5 1cm)或用灼烧过的接种针在菌落边缘上打块 或挑取边长0. 4 0. 7cm的菌丝琼脂块。选取高度为5士0. 5cm较粗壮的无菌台湾金线莲组培苗，去掉顶部，用灭菌的解剖 刀切成2 4个茎段，每个茎段保证1个以上的茎节，然后接到共生培养基中，每个瓶子接 入4个茎段。最后挑取丝核菌(Rhizoctonia sp.) JSH-1菌丝琼脂块置于四个茎段中间，同 时设有对照，即不接菌。上述所有操作过程均在无菌超净台上操作。培养条件温度25°C ；光照强度15001x，光照时间12h/d ；培养时间80天。结果分析本发明丝核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1对金线莲组培苗原球茎生长 有显著促进作用。具体表现为10天后接菌金线莲茎段逐渐变得粗壮，15天左右开始出现 原球茎，两个半月后单株原球茎个数高达9个，并且许多已经分化成非常粗壮的幼苗(图 4)。而对照基本没有生长，没有任何原球茎的出现(图5)。因此，采用本发明所述的茎段共生式金线莲组培共生培育方法，可以大大降低使 用金线莲组培苗的成本，缩短生长周期，提高存活率，从而降低其生产成本。
权利要求
一种金线莲共生苗的生产方法，其特征在于该方法包含如下步骤1).以丝核菌(Rhizoctonia spp.)作为内生真菌进行培养并制作菌丝琼脂块；2).金线莲组培共生将无菌金线莲组培苗去掉顶部叶芽，分成茎段，然后与丝核菌(Rhizoctonia spp.)菌丝琼脂块接种到共生培养基中共同培养，通过菌丝侵入茎部切口，刺激茎节叶芽发育成类原球茎，进而发育成共生苗。
2.根据权利要求1所述的金线莲共生苗的生产方法，其特征在于所述金线莲组培共 生的培养条件为在纯培养条件下20 25°C培养，光照强度为500 25001x，每天光照 10 13小时，培养2 3个月。
3.根据权利要求1所述的金线莲共生苗的生产方法，其特征在于所述金线莲组培苗 的每个茎段上至少具有一个以上的茎节。
4.根据权利要求1所述的金线莲共生苗的生产方法，其特征在于所述共生真菌的接 种时间为与金线莲组培苗茎节同时接种或提前3 7天接种。
5.根据权利要求1所述的金线莲共生苗的生产方法，其特征在于所述的丝核菌 (Rhizoctonia spp.)为由野生金线莲根部分离所得到的保藏编号为CGMCC N0. 3074的丝核 菌(Rhizoctonia sp.)JSH-l。
全文摘要
本发明涉及一种金线莲共生苗的生产方法。该方法包含如下步骤1)内生真菌的培养将由野生金线莲根部分离所得到的保藏编号为CGMCC NO.3074的丝核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1从低温保藏的斜面试管菌种活化后，转入PDA平板，28℃黑暗培养2～4天；然后制作菌丝琼脂块；2)金线莲组培共生将无菌金线莲组培苗去掉顶部叶芽，采用无菌操作，从两茎节中部切断，得到2～4个茎段，然后与丝核菌(Rhizoctonia sp.)JSH-1菌丝琼脂块同时接到共生培养基共同培养2～3个月。采用本发明所述的茎段共生式金线莲组培共生培育方法，可以大大降低使用金线莲组培苗的成本，缩短生长周期，提高存活率，从而降低其生产成本，有利于实现产业化生产。
文档编号C12N1/14GK101855994SQ200910210058
公开日2010年10月13日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者张善信, 方祥, 江绮晴, 陈春满 申请人:东莞市生物技术研究所;华南农业大学