专利名称：红厚壳的快速繁殖技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及红厚壳的组织培养，尤其涉及红 厚壳的快速繁殖技术。
背景技术：
红厚壳属(Ca/o/ /o^MmL)为藤黄科(GMmyferae)植物，为国家二级保 护植物。在我国的海南岛和东南亚、印度、非洲等热带地区都有分布。红厚壳 又名胡桐、海棠果，经济价值高，应用范围广。具有油用、药用、材用、观赏、 生态保护等多种用途。1992年美国国家癌症研究所(NCI)从马来西亚生长的 红厚壳属植物C.La/i!'geram中分离出的香豆素具有抗fflV-l活性成分，发现是 目前抗HIV-1活性最强的天然活性成分(Kashman et al. J Med Chem， 1992， 35: 2735-2743)。
我国有4种红厚壳植物，其中海南分布2种，分别为红厚壳(OzZo/7/iyZZMm jM0p/13^"m Li肌)和薄叶红厚壳(C. memforawacewm Gard打.ef C7iflm/ .)， 目前
大都处在野生状态。由于砍伐和土地利用等，使红厚壳仅在某些地区小范围存 在。国内对红厚壳资源利用、保护和开发还没有进行过系统的科学研究，经济 利用价值还没有完全开发出来，特别是还缺乏栽培技术，产量低、株间差异大、 经济效益差。根据陶忠良(陶忠良，资源开发与市场，2003， 19: 85 — 87)报 道，红厚壳植株生长较缓慢，幼苗生长6个月株高达40 50cm，但生长10年 后才能结果。
植物组织培养技术日趋完善，并在科学研究与现代化农业生产中充分显示出其优越性，在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、改革作物栽培、细胞工程和 基因工程育种以及种质保存等方面都发挥巨大的作用，是一项具有广阔发展潜 力的高新技术。目前海南红厚壳组织培养植株再生植株的相关研究尚未见有t艮 道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种稳定性好、繁殖率高、人 工可控且操作简便的红厚壳的快速繁殖技术，该技术通过种子无菌萌发和腋芽 诱导萌发获得大量、整齐的组培苗。
本发明的上述目的是通过如下方法予以实现的
一种红厚壳的快速繁殖技术，该技术包括红厚壳种子无菌萌发和红厚壳腋 芽诱导萌发两步，其具体步骤如下-
(1) 红厚壳种子无菌萌发
成熟红厚壳果实去果壳后，将种子经消毒处理后对半横切开，取有胚的一 半接种到无菌琼脂培养基中，光照培养，得到萌发的幼苗；
(2) 红厚壳腋芽诱导萌发
a. 将上述红厚壳种子光照培养的幼苗在无菌条件下切取带节茎段，接入腋 芽诱导萌发培养基中培养；所述腋芽诱导萌发培养基的配方为MS+1.0mg/LD-萘乙酸+0.5mg/LTDZ+8.0g/L琼脂+40 g/L蔗糖；TDZ为苯基脲衍生物，全称 为N一苯基一Nll ,2,3一噻二唑一5J尿，是本领域技术人员常用的植物组织高效生 物调节剂；
b. 将腋芽诱导萌发培养基中培养后的腋芽转入含活性炭的继代培养基中 培养，从而获得所需红厚壳幼苗；所述含活性炭的继代培养基配方为l/2MS+0.5g/L活性炭+8.0g/L琼脂+30 g/L蔗糖。
上述红厚壳种子无菌萌发中，成熟红厚壳去果壳后，将种子进行消毒处理， 可采用本领域技术人员的常规操作，也可以按照如下步骤进行消毒处理用 75体积％乙醇溶液消毒种子30秒，无菌水冲洗后，再用0.1% (质量百分比) 的氯化汞溶液消毒种子15分钟，无菌水冲洗3次；红厚壳种子的表面光滑， 在0.1%的氯化汞溶液中滴1滴吐温，可增加消毒的效果。
上述红厚壳种子无菌萌发中，红厚壳种子含胚的一端呈圆锥形，另一端为 半圆形，切种子时不要伤到胚。
上述红厚壳种子无菌萌发中，将有胚的一半接种到无菌琼脂培养基中，该 无菌琼脂培养基的配方为只含有0.8%琼脂(质量百分比)，不含有其他任何 营养成分。
上述红厚壳种子无菌萌发中，光照培养的培养条件为温度为28士rc， 相对湿度为70±5%，光照条件为12小时/每天，光照强度为10±l|nmol/m2 " (表示"微摩尔/平方米X秒")，培养萌发幼苗。
上述红厚壳腋芽诱导萌发中，待红厚壳种子光照培养的腋芽展开6-8片叶 时，在无菌条件下切取带节茎段，每一棵腋芽可切取3个带节茎段，将带节茎 段接入腋芽诱导萌发培养基中培养;培养温度为28± 1°C ，相对湿度为70±5%， 每天光照12小时，光照强度为10土liimol/m、s 。
上述红厚壳腋芽诱导萌发中，腋芽切取的带节茎段在腋芽诱导萌发培养基 中培养21 28天后，转入含活性炭的继代培养基中培养，培养温度为28土1 。C，相对湿度为70±5%，每天光照12小时，光照强度为10士Uimol/m2's ， 一般培养14 21天。上述红厚壳腋芽诱导萌发中，步骤(1)的腋芽诱导萌发培养基配方和步
骤(2)的继代培养基配方中的MS为本领域技术人员进行组织培养时最常用 的基础培养基，市场上均有成品销售。
经上述红厚壳快速繁殖技术得到的红厚壳幼苗，可用于后续的生根培养、 炼苗和移栽，采用本领域技术人员常用的生根培养、炼苗和移栽技术，均能获 得很好的效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明的快速繁殖技术其培养条件操作简单，人工可控，由于组培苗在 无菌条件下生长，营养充足，温度适宜，光照充分，不受季节、气候的限制，
可周年生产组培试管苗；
2. 本发明通过红厚壳种子无菌萌发和红厚壳腋芽诱导萌发两步，即可获得 完整再生植株速度快，繁殖率高；
3. 本发明培养所得幼苗健壮、整齐，为大量获得幼嫩枝叶提供有效途径；
4. 采用本发明的快速繁殖技术， 一颗红厚壳种子一年可生产出2187棵组 培苗。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发
明做任何限定。 实施例l
本实施例的红厚壳快速繁殖，包括红厚壳种子无菌萌发和红厚壳腋芽诱导 萌发两步，其具体步骤如下 l.红厚壳种子无菌萌发把50个成熟红厚壳果实去除果壳，用75体积％乙醇溶液消毒种子30秒， 再用0.1% (质量百分比)的氯化汞溶液消毒种子15分钟，无菌水洗3次后， 将消毒的种子对半横切开，将有胚的一半接种到装有无菌琼脂培养基的培养瓶 中，将培养瓶置于光照培养箱中培养，温度为28土rC，相对湿度为70±5%， 光照条件为12小时/每天，光照强度为10士lMmol/m2 s;所述无菌琼脂培养 基的配方为只含有0.8% (质量百分比)的琼脂，不含有其它任何营养成分。
2.诱导红厚壳腋芽萌发 (l)待上述培养瓶中萌发的幼苗展开6一8片叶时(此时腋芽高度为6-7cm)， 将幼苗移出瓶，在无菌条件下切取带节茎段，每棵腋芽可切取3个带节茎段， 接入腋芽诱导萌发培养基中，腋芽诱导萌发培养基的配方为MS+1.0mg/Ll]-萘乙酸+0.5mg/LTDZ+8.0g/L琼脂+40g/L蔗糖；培养温度为28士rC，相对湿 度为70±5%，每天光照12小时，光照强度为10±lpmol/m2 s ;
(2) 上述带节茎段在腋芽诱导萌发培养基中培养28天后，将萌发的腋芽 转入继代培养基中培养14天，继代培养基的配方为l/2MS+0.5g/L活性炭 +8.0g/L琼脂+30 g/L蔗糖；培养温度为28士rC，相对湿度为70±5%，每天 光照12小时，光照强度为10士l(Limol/m、s ;
(3) 当每个带节茎段萌发的腋芽为2-4个，腋芽生长至6—7厘米高时，无 菌条件下切取腋芽，重复上述步骤(1)和(2) 5次。
本实施例红厚壳种子经上述方法快速繁殖后， 一年大约可生产出2187棵幼
苗，50颗种子可生产出109350棵幼苗。 实施例2
本实施例的红厚壳快速繁殖技术其它操作同实施例1 ，不同的是 2.诱导红厚壳腋芽萌发(1)腋芽诱导萌发培养基的配方为MS+1.0mg/L NAA
+2.0加^6-8八+0.2111^丁02+8.0^琼脂+40 g/L蔗糖；所述NAA为D凑乙酸，
所述6-BA为细胞分裂素；
(2)带节茎段在腋芽诱导萌发培养基中培养21天，腋芽萌发后转入含活性
炭的继代培养基中培养，含活性炭的继代培养基配方为1/2MS+1.0g/L活性
炭+8.0g/L琼脂+30 g/L蔗糖；
采用本实施例的快速繁殖技术，红厚壳种子一年大约可生产出192棵幼
苗，50颗种子可生产出9600棵幼苗。 实施例3
本实施例的红厚壳快速繁殖技术其它操作同实施例1 ，不同的是 2.诱导红厚壳腋芽萌发
(1)腋芽诱导萌发培养基的配方为MS+l.Omg/L NAA +2.0mg/L6-BA +8.0g/L琼脂+40 g/L蔗糖；所述NAA为D凑乙酸，所述6-BA为细胞分裂素； (2)带节茎段在腋芽诱导萌发培养基中培养21天，腋芽萌发后转入含活性 炭的继代培养基中培养，含活性炭的继代培养基配方为1/2MS+2.0g/L活性 炭+8.0g/L琼脂+30 g/L蔗糖；
采用本实施例的快速繁殖技术，红厚壳种子一年大约可生产出81棵幼苗， 50颗种子可生产出4050棵幼苗。
由实施例l、 2和3的结果可以看出，本发明的红厚壳快速繁殖技术中， 腋芽诱导萌发培养基的优选配方为MS+1.0mg/Ltl-萘乙酸+0.5mg/L TDZ+8.0g/L琼脂+40 g/L蔗糖；液压诱导培养基的培养时间优选28天；含活 性炭的继代培养基的优选配方为V2MS+1.0g/L活性炭+8.0g/L琼脂+30 g/L
权利要求
1、一种红厚壳的快速繁殖技术，其特征在于该技术包括红厚壳种子无菌萌发和红厚壳腋芽诱导萌发两步，具体步骤如下(1)红厚壳种子无菌萌发成熟红厚壳果实去果壳后，将种子经消毒处理后对半横切开，取有胚的一半接种到无菌琼脂培养基中，光照培养，得到萌发的幼苗；(2)红厚壳腋芽诱导萌发a.将上述红厚壳种子光照培养的幼苗在无菌条件下切取带节茎接入腋芽诱导萌发培养基中培养；所述腋芽诱导萌发培养基的配方为MS+1.0mg/L id="icf0001" file="A2009101924890002C1.tif" wi="2" he="5" top= "103" left = "184" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>-萘乙酸+0.5mg/L TDZ+8.0g/L琼脂+40g/L蔗糖；b.将腋芽诱导萌发培养基中培养后的腋芽转入含活性炭的继代培养基中培养，从而获得所需红厚壳幼苗；所述含活性炭的继代培养基配方为1/2MS+0.5g/L活性炭+8.0g/L琼脂+30g/L蔗糖。
2、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述红厚壳为
3、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述成熟红厚壳果实去果壳后，将种子经如下方法进行消毒处理用75体积％乙醇溶液消毒种子30秒，无菌水冲洗后，再用0.1质量％的氯化汞溶液消毒种子15分钟，无菌水冲洗3次。
4、 根据权利要求3所述快速繁殖技术，其特征在于所述0.1质量％的氯化汞溶液中滴加有吐温。
5、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述步骤(1)中，无菌琼脂培养基的配方为含有0.8质量％琼脂。
6、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述步骤(1)中，光照培养的培养温度为28土rC，相对湿度为70±5%，每天光照12小时，光照强度为10±lpmol/m2 s 。
7、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述步骤(2)中，腋芽诱导萌发培养基的培养温度为28士rC，相对湿度为70±5%，每天光照12小时，光照强度为10±l|Limol/m2 s。
8、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述步骤(2)中，带节茎段在腋芽诱导萌发培养基中培养21 28天后，转入含活性炭的继代培养基中培养。
9、 根据权利要求1所述快速繁殖技术，其特征在于所述步骤(2)中，含活性炭的继代培养基中的培养温度为28士rC，相对湿度为70±5%，每天光照12小时，光照强度为10士Uimol/m、s 。
全文摘要
本发明公开一种红厚壳的快速繁殖技术，该技术包括红厚壳种子无菌萌发和红厚壳腋芽诱导萌发两步，具体步骤如下(1)红厚壳种子无菌萌发成熟红厚壳果实去果壳后，将种子经消毒处理后对半横切开，取有胚的一半接种到无菌琼脂培养基中，光照培养，得到萌发的腋芽。(2)红厚壳腋芽诱导萌发a.将上述红厚壳种子光照培养的腋芽在无菌条件下切取带节茎段，接入腋芽诱导萌发培养基中培养；b.将腋芽诱导萌发培养基中培养后的腋芽转入含活性炭的继代培养基中培养，从而获得所需红厚壳幼苗。本发明的培养操作简单，人工可控，可周年生产组培试管苗，可获得完整再生植株速度快，繁殖率高。
文档编号A01H4/00GK101647394SQ200910192489
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者王小菁, 许德成 申请人:华南师范大学