专利名称：离体快速繁殖地乌的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体快速繁殖地乌的方法。
背景技术：
地乌，其学名是林荫银莲花(Anemone Flaccida Fr. Schmidt)为多年生草本，属于毛茛科银莲花属植 物，其干燥根茎称为地乌，俗称地乌。每年3 5月为地乌地上部生长发育时期。基生叶1一2片，长叶柄， 五角形，长2 7cm，宽3 10cm。根状茎近圆柱形，最大直径为lcm, 3 5年方能采收入药。地乌野生 资源主耍分布丁长江中下游各省海拔1500 3000m的山坡林下阴湿处，鄂西山地分布相对集中。由此看来， 野生地乌分布面积有限，生长期短，生长缓慢，生物量小，属于珍稀植物。
地乌性味温、辛、微苦，由地乌提取物制成的银莲花胶囊具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，地 乌对类风湿性关节炎有良好的治疗作用.而且毒副作用很小。由于野生地乌珍稀，对地乌进行中成药开发； 不能仅仅依靠野生资源，必须规模化人工栽培，否则，将导致地乌野生资源枯竭，自然生态环境遭到破坏。
通过检验，地乌种子活力很低，目前，在实验室条件下很难用其种子直接发芽生产地乌种苗。因此， 现阶段地乌规模化人工栽培的种苗只嫩那个通过地乌的离体繁殖(组织培养)来获取，关于地乌的离体快 速繁殖目前国内外文献中尚未见报导。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种离体快速繁殖地乌的方法，以縮短常规育苗时间， 提高育苗效率，实现地乌的快速繁殖。 本发明通过以下技术方案实现 一种离体繁殖地乌的方法，包括以下步骤 (1)外植体的选择与消毒
1) 选择地乌根茎带老组织的长度为l-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；
2) 将该外植体用如下方法进行消毒
a. 外植体为休眠芽的消毒先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎 芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5。/。的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗0.5h, 转移至超净工作台，用75%酒精消毒30-60 s,无菌水冲洗l-2遍，再用0.2%升汞溶液消毒8-12 min，无菌 水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为min，备用；
b. 外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净T.作 台上，用75。/。酒精消毒30s， 0.2%升汞消毒5 min，无菌水冲洗2-3遍，备用；
(2)接种与培养用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成lcmXlcm小块；或将休 眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱 诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤 组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为每天光照12h,培养温度17-20。C;
光照强度3000Lux,得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；
(3) 继代、增殖与分化培养将步骤(2)得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基 上进行增殖培养；或将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，
进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件每天光照12h，培养温度17-20 'C,光照强度为3000Lux;
(4) 生根培养将步骤(3)的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养40-50d，使其生根； 培养条件为5'C,暗培养；
所述培养基成分如下
不定芽或拟球茎诱导培养基MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;
胚性愈伤组织诱导培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;
不定芽或拟球茎增殖培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;
胚性愈伤组织增殖培养基MS基本培养基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8°/^1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;
分化培养基MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂， 3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;
生根培养基1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8°/<^1°/。琼脂，3%蔗糖，补 充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0。
为了叙述方便，在本说明书的后面部分，申请人将"休眠芽"，称之为"芽或地乌芽"，将"刚萌发未 展开的叶片"称之为"叶片或地乌叶片"，其含义同上述的定义是一个意思。
本发明的效果是
(1) 本发明采用的外植体来源不受季节限制，可以周年进行地乌的组织培养；
(2) 离体培养下的地乌体细胞胚可通过次生胚不断增殖；具有良好的增殖效果；
(3) 本发明的方法对提高不定芽、拟球茎诱导率和体细胞胚分化率显著。 更详细的技术方案见《具体实施方式
》。
图la和图lb:是以地乌刚萌发未展开的叶片为外植体诱导产生的丛生芽。 图2a和图2b:是以地乌休眠芽为外植体诱导产生的丛生芽。 图3a和图3b:是以地乌刚萌发未展开的叶片为外植体诱导产生的拟球茎。 图4a和图4b:是以地乌休眠芽为外植体诱导产生的拟球茎。 图5:是以地乌休眠芽为外植体，经过体细胞胚发生途径的不同阶段外植体形态
具体实施例方式
实施例1 (通用培养程序) 一种离体快速繁殖地乌的方法，其步骤如下(1) 外植体的选择与消毒
1) 选择地乌根茎带老组织的长度为l-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体；
2) 将该外植体用如下方法进行消毒
a. 外植体为休眠芽的消毒先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎 芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5。/。的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗.Q.5h， 转移至超净工作台，用75%酒精消毒30-60 s，无菌水冲洗l-2遍，再用0.2%升汞溶液消毒8-12111111，无菌 水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为lmin，备用；
b. 外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作 台上，用75°/。酒精消毒30s， 0.2。/。升汞消毒5min，无菌水冲洗2-3遍，备用；
(2) 接种与培养用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成lcmXlcm小块；或将休 眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱 诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤 组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为每天光照12h，培养温度17-2(TC， 光照强度3000Lux，得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织；
(3) 继代、增殖与分化培养将步骤(2)得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基 上进行增殖培养；或将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，， 进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件每天光照12h，培养温度17-20 'C，光照强度为3000Lux;
(4) 生根培养将步骤(3)的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养40-50d，使其生根； 培养条件为5'C，暗培养；
所述培养基成分如下
不定芽或拟球茎诱导培养基MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;
胚性愈伤组织诱导培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.80/。~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;
不定芽或拟球茎增殖培养基MS基本培养基+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L,调pH至5.8-6.0;
胚性愈伤组织增殖培养基MS基本培养基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，头孢噻诉钠300 mg/L' 0.8%~1%琼脂，3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;
分化培养基MS基本培养基+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA,头孢噻肟钠300 mg/L， 0.8%~1%琼脂， 3%蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0;
生根培养基1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA，头孢噻肟钠300 mg/L' 0.8°/<^1%琼脂'3%蔗糖'补 充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0。
生根培养基1/2MS基本培养基+0.2mg/LNAA,头孢噻肟钠300 mg/L' 0.8%~1%琼脂'3%蔗糖'补 充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0。
具体步骤
外植体的选择与消毒
本发明的核心之一是对地乌外植体进行消毒，以建立地乌的无菌(消毒)培养体系，而该体系是本发 明之前从未见报道。
由于地乌是多年生地下根茎，共生真菌、内生细菌多，其作为培养材料来源，首先要解决外植体污染 问题。在保证外植体成活的前提下，通过外植体的预处理，筛选消毒剂种类、浓度，优化消毒方案，以及 在培养基中添加不同抗生素等方法，来消除组织培养中污染，以期建立起地乌组织培养无菌体系。
在选用带有老组织材料为外植体时，不同消毒剂种类、浓度和消毒时间进行组合，用0.2%升汞消毒 9min，在保证一定成活率的同时能够有效控制污染；为了有效控制外植体中出现的真菌污染，操作中对外 植体用杀菌剂进行预处理，用不同浓度的多菌灵、84消毒液(购自武汉东湖星科技公司商品)、不同处理 时间对比试验发现，以1.5。/。多菌灵浸泡外植体2h，能够有效控制外植体中的真菌污染，保证操作高效进 行。
为了控制培养初期和培养后期外植体中内生菌造成的污染，本发明进行了不同种类、浓度抗生素的组 合试验，以头孢噻肟钠(华北制药股份有限公司)300mg/L的浓度最佳，能够控制外植体内生菌造成的污 染，同时也不会对外植体的生长造成抑制作用，所以在本实施例的全过程的培养基中均添加有该抗生素。
以叶片、叶柄、根茎和带老组织的芽为外植体，进行对比试验，叶片和芽均能诱导出芽和愈伤组织， 且以芽为外植体的诱导率为最高。
具体操作步骤以带部分老组织的地乌根茎芽(l-2cm)为外植体，在自来水下，将外植体表面的泥 沙清洗干净，于1.5。/。的多菌灵水溶液中浸泡2h，将芽放入小烧杯中，将其用自来水下冲洗0.511,转至超 净丄作台，置于已灭菌的100 mL三角瓶中，加入75%酒精，不停振荡，30 s后用无菌水冲洗一遍，再将 外植体转入另一己灭菌的100mL三角瓶中，加入0.2%的升汞，滴加2滴吐温-20，不停振荡，消毒7min， 弃去升汞溶液，外植体用无菌水冲洗5遍，每次冲洗时间不少于1 min，直至无菌水中无泡沫止。
叶片为外植体，将叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作台，用75%酒精消毒时间少于15 s， 0.2% 升汞消毒5 min。其他步骤均与芽处理相同。
2、 接种
芽接种时，按不同的接种方式进行对比试验，接种方式有完整的芽、1/2芽(4mm)、纵切薄片(2mm) 和横切薄片(2mm)。其中以1/2芽成活率和诱导率为最高。
具体操作将消毒好的外植体，转移到培养皿中的滤纸上，吸去表面的水分，将芽体外层老组织切除 后，从芽体中间将芽剖开，侧放于培养基表面即可，于15-20 'C光照条件下培养，光照强度3000 lux，光 照时间为12h/d。
以叶为外植体，接种时，进行了不同接种方式的对比，接种方式有完整未展开叶、完整展开叶背面接 触培养基、完整展开叶腹面接触培养基、叶片0.5cm方块背面接触培养基和叶片0.5cm方块腹面接触培养 基。其中以完整未展开叶诱导率和成活率为最高。
具体操作将消毒好的外植体，转移到培养皿中的滤纸上，吸去表面的水分'将叶柄切除，接种至培 养基表面即可，于15-20。C光照条件下培养，光照强度3000 lux,光照时间为12h/d。
3、 诱导和继代培养
本发明在外植体芽和叶片接种成活后，对其进行诱导和继代培养，这一过程中进行了一系列的激素配
比试验。其中不定芽或拟球茎诱导培养基最佳配方为MS基本培养基+2.0 mg/L6-节氨基嘌呤(6-BA) +0.2 mg/L萘乙酸(NAA),同时此培养基也是不定芽和拟球茎增殖培养基。胚性愈伤组织诱导培养基的最佳配 方为MS基本培养基+2.0mg/L6-BA十1.0mg/LNAA，胚性愈伤组织增殖培养基为MS基本培养基+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。
步骤是外植体(地乌芽或叶片)接种于不定芽或拟球茎诱导培养基上，每30d用同样的培养基继代 一次，培养初代芽体开始膨大，表面轻微愈伤化，形成瘤状的小突起，50d左右，开始产生嫩绿色新芽。 外植体在胚性愈伤组织诱导培养基上培养45d左右，在外植体伤口处，产生胚性愈伤组织，将胚性愈伤组 织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上培养，使其迅速增殖。
4、生根培养
本发明在根的诱导试验过程中，进行了激素种类、浓度和培养条件的试验，以1/2MS基本培养基+0.2 mg/LNAA (成分参见生根培养基)，5'C，暗培养为最佳组合。
步骤是将离体培养的不定芽和拟球茎，转移到生根培养基上进行生根培养(1/2MS基本培养基+0.2 mg/LNAA)，在5'C下暗培养40d后长出根，炼苗后移栽。
本发明可以快速繁殖地乌组培苗。本发明操作简便，分化指数高。通过组织培养可快速生产地乌繁殖 体，是一种投资少、见效快的组培苗生产技术。本发明可以保持地乌自身优良的生药学特性，以用于地乌 中成药的开发，具有可观的经济效益。同时，应用本发明可有效保护野生地乌资源，具有良好的生态效益；
实施例2
试验材料选择、培养基设计与接种培养 1、实验材料来源及其处理
选用来自湖北省长阳土家族自治县麻池铜鼓包海拔1800米左右山区野生地乌根状茎作为试验材料。 使用前，将地乌根状茎用申请人在先的发明专利中请(专利申请号:200810047075.X,
发明者张忠池, 方贤东, 朱端卫, 李宏飞, 杨特武, 俊 王, 耿明建, 龙 辛, 黄漫翔 申请人:华中农业大学