专利名称：：与猪肉质性状相关的分子标记的克隆与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于家畜基因工程中的分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择关联分析的与猪肉质性状相关的分子标记及其在关联分析中应用。
背景技术：
：猪是为人类提供动物蛋白的最主要畜种之一，猪的产肉性状(包括瘦肉产量和质量)是其经济价值的重要体现。骨骼肌是动物体内最丰富的组织，在肉用动物中占总体重的45-60%。猪瘦肉产量和质量在遗传因素上主要取决于骨骼肌的肌纤维生长发育程度，亦即胚胎发育期肌纤维数目的多少和生后期肌纤维体积的大小。肌纤维体积大小适宜且数目较多的猪只瘦肉产量高，肉质优良。骨骼肌的生长建立在肌细胞分化与增殖基础之上。哺乳动物肌肉生长分化主要包括三个阶段，即成肌细胞(myoblast)分化形成、成肌细胞迁移、增殖和肌管(myotube)形成。上述三个阶段从微观水平上是一个极为复杂过程，涉及大量基因表达和调节因子的网络式调控。分子生物学技术的发展，以及肌肉受损后再生机制研究的深入，使得对骨骼肌生长分化相关基因的数目、功能及作用机制有了更多了解。然而，在现有研究结果基础上，还亟待解决一些重要问题(1)除少数重要调控因子(如MRFs、MEF-2)的作用机制及通路较清楚外，多数相关基因或调控因子间的作用机理尚不清晰；(2)已知功能的骨骼肌生长分化相关基因数目偏少；(3)可用于猪产肉性状相关的候选基因数目少；(4)在单基因水平上进行相关基因的挖掘与功能分析，其成效日渐甚微。因此，从全基因组水平上对猪骨骼肌生长分化相关基因进行继续分离和研究很有必要。TMODJ是一个40.6KD的蛋白，与TM结合并稳定其突出末端。TM结合肌动蛋白丝并抑制它们的解聚，参与构成和调节肌动蛋白丝的长度。最初认为是红细胞膜的一部分，最近发现它与骨骼肌细丝末端有相互作用。人红细胞抗体和其它组织的蛋白反应表明rM(9Z)/出现在中枢神经系统的神经肌肉突触联接、心肌、晶状体中。rMOD7在多种细胞中参与肌动蛋白丝的结构组成。tmoz)/对细胞和机体的存在有重要作用。tmod7过表达导致肌动蛋白丝縮短和引起肌纤维退化，在培养的新生鼠心肌细胞中，通过抗体和反义mRNA抑制rMOZ)J的成帽活性，促使形成变长的肌动蛋白丝。另外，转基因鼠中tmod/的过表达，出现与扩张性心肌病和心肌衰退肥大反应同样的症状。靶向断裂ra/o"/基因的老鼠，心脏发育，血管发生和造血功能停止，在妊娠期9.5—10.5天死亡。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术缺陷，通过PCR扩增7MO"7基因游cDNA部分片段，寻找突变位点，筛选一种与猪肉质性状相关的分子标记，利用该分子标记作为猪的标记辅助选择关联分析中的应用。本发明通过以下技术方案实现-申请人克隆得到一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。在该序列表SEQIDNO:1的第134位碱基处有一个A134-G134的碱基突变，导致RFLP-MraI多态性。制备检测上述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示正向5'AGTTCAGCATCGTGGGGACA3'，反向5，AATGCACCTGAAACACCACACAG3，。一种如权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，按照以下步骤用人rMOA基因mRNA(GenBank收录号NM—003275)为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90%以上的表达序列标签(EST);然后对EST进行拼接；根据与人rMOD/基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物，提取DNA,PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本发明的分子标记为猪的分子标记辅助选择的关联分析提供了一个新的分子标记。更详细的技术方案参见《具体实施方式》。序列表SEQIDNO:1是本发明克隆的猪肉质性状相关基因rJkrODJ部分cDNA序列。图l:是本发明的技术流程图。图2:克隆rMO"7基因部分cDNA序列。其中第134位碱基处的括号内为等位基因的突变位点(A134-G134)。图3:本发明中TMODJ基因部分cDNA序列电泳图谱，片段大小为739bp(琼脂糖胶浓度为2°/。)。图中M泳道为DNA分子量标准(DL2000)。图4:本发明rMOIU基因部分cDNA序列测序图，在显示双峰位置发生等位基因突变。图5:本发明中TMO"/基因第七外显子的RFLP-MraI的三种基因型(AAABBB)电泳图谱。具体实施例方式实施例1:(一)基因部分cDNA序列PCR扩增及第七外显子序列扩增(1)引物设计用人ZMO"7基因mRNA(GenBank收录号NM—003275)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90。/。以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov八Veb/Search/index.html)査询相应序列，然后用序列分析软件DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群，获得部分cDNA序列。设计引物，进行PCR扩增、产物纯化及测序，获得如序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，发现了l个碱基突变位点。根据与人TMOA基因的mRNA序列的比对，该位点位于猪rMOZ^基因第七外显子。PCR扩增第七外显子部分序列(lllbp)，如序列表SEQIDNO:2所示，突变位点位于其80bp处。对此突变位点进行酶切分析，发现该突变恰好影响着内切酶I的识别。扩增TMOD7基因部分cDNA序列并测序的引物如下所示正向5'AGTTCAGCATCGTGGGGACA3'，反向5，AATGCACCTGAAACACCACACAG3，。扩增rMOD7基因第七外显子并检测A80-G80处碱基突变所用的引物序列如下所示正向5，AGATGCTCAAAGTGAACAAGGTG3，，反向5'CCAGAGAAGTGTTGTATGGAAGA3'。(2)PCR产物的纯化和测序PCR扩增SEQIDNO:1lOpL体系双蒸水5.9pL、10xbufferlpL、25mMMg2+0.6^L、2.5mMdNTP0.8)iL、正向引物0.3nL、反向引物0.3nL、5U尔LTaq酶O.lpL、长新猪cDNA1jiL。扩增条件94'C预变性5min、94。C变性30s、62。C退火30s、72'C延伸30s、35个循环、72°C再延伸5min。共10管。PCR产物经2X琼脂糖凝胶电泳检测。SEQIDNO:210pL体系双蒸水7pL、10xbufferlnL、2.5mMdNTP0.8^L、正向引物0.3pL、反向引物0.3^L、5U/nLTaq酶0.1nL,通城群体基因组DNA0.5pL。扩增条件94°C预变性5min、94t:变性30s、62。C退火30s、72。C延伸15s、35个循环、72。C再延伸5min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。共184个样本。SEQIDNO:1PCR产物的回收使用博大泰克公司小量DNA回收试剂盒。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mLEpendorff管中，按每100吗1%凝胶加入70(HiL溶胶液的比例，加入溶胶液，于65。C温育至凝胶完全融化。将胶液上柱，体积过大可分几次上柱，9000rmp离心30s。倒掉收集管中液体，在吸附柱中加入500pL漂洗液，1200rmp离心30s，倒掉收集管中液体，重复此操作一次。将柱子1200rmp离心2min,除去乙醇。将吸附柱放入新的1.5mLEpendorff管中，往柱子中央加入30pL双蒸水，室温放置2分钟，1200rmp离心2min，得到回收产物。检测，送公司测序。(3)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。(二)PCR-RFLP诊断方法建立RFLP检观!l:10pL酶切体系双蒸水3.8^L、10xBufferlpL、限制性内切酶AfvaI0.2pL(IOU尔L)、PCR产物5pL。将样品混匀后离心，37。C培养箱放置12h。2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。扩增猪基因组DNA得到了第七外显子lllbp特异性扩增片段(详见图5)，序列分析结果表明在134bp处存在A134-G134突变，并导致RFLP-MwI多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因，G是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型，其中AA型为未发生酶切的纯合型(电泳检测时只有lllbp—条DNA带)，BB型为发生酶切的纯合型(电泳检测时出现78bp和33bp两条DNA带)，AB为杂合型(电泳检测时出现lllbp、78bp和33bp三条DNA带)。(三)PCR-^/va/-RFLP多态性在各猪品种中的分布情况的关联分析的应用利用PCR-MraI-RFLP检测了华中农业大学保存的來自于国内外血缘的猪种，即湖北省通城县地方猪品种"通城猪"群体，国外品种"长白"、"大白"，中外杂交猪品种"长大通"，"大长通"。所述的突变位点在不同猪种中的基因型和基因频率如表l所示。结果显示在"长白"、"长大通"、"大长通"中A等位基因占优势，在"通城猪"、"大白"中B等位基因占优势。x"检验表明，5个品种间基因型频率和基因频率差异均不显著。表1:几个猪品种中rwrf7基因A/G突变位点的基因型和基因频率<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>基因与性状间的关联分析采用广义线性模型(GLM):Yijk二n+Bi+Aj+Gk+eijk，(Yijk:性状观察值；H:群体均值；Bi:品种效应；Aj:屠宰批次效应；Gk:基因型效应；eijk:'随机残差效应)，分析软件为SAS8.1软件。性状关联分析结果表明基因型和腿臀比率、pHl显著相关。通城群体的肉质性状的最小二乘均数和标准误见表2。_表27>noW基因A/G突变位点不同基因型对肉质性状的影响_<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>说明书第5/6页胸腰椎膘厚(cm)2.57±0.112.58±0.092.44±0.090.7654眼肌估算面积(cm2)32.43±0.6932.42±0.5833.49±0.580.3063腿臀比率(％)30.72a±0.2430.50a±0.2029.92b±0.200.0156腿臀肉骨率(％)68.95±0.6368.59±0.5469.42±0.530.5077肉色3.06±0.063.10±0.053.08±0.050.8830大理石纹2.19±0.092.37±0.082.46±0.080.0599pHl6.36a±0.046.48b±0.036.49b±0.030.0210失水率(％)14.39±0.7713.60±0.6512.91±0.650.3044肌内脂肪含量(％)2.54±0.132.47±0.112.72±0.110.2018由表2可知rMOZ)/基因第七外显子多态性位点对腿臀比率、pH值有显著影响(p0.05)。AA和AB基因型的腿臀比率显著高于BB基因型(p<0.05)，因此A等位基因是腿臀比率的有利标记AA基因型的pH值显著低于AB基因型(p<0.05)和BB基因型(p<0.05)，因此A等位基因是pH值偏低标记。序列表<110〉华中农业大学<120>与猪肉质性状相关的分子标记的克隆与应用<130><141>2008-08-28<160〉1<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉739<212>DNA<213〉猪(Susscrofa)<220>〈221〉gene<222>(l)..(739)〈223〉<220〉<221><222〉〈223〉<220〉<221〉〈222><223><220><221〉<222〉<223〉primer—bind(717)..(739)primerjaind(l)..(20)mutation(134)..(134)<400>1agttcagcatCgtgggg￡LC3cggsgt犯tgaccccgtggcgttcgcccttgctg卿tgc60頃ggtgUgaagacgctgaatgtggagtctccggagccg120ggatcctgcgcctggtgg犯gctcttccatacaacacttctctggtggaactg犯gatcg180ccagcccctgtgg卿tggELgatcgtaagc3tgttgg犯3240gcttctc犯gttcggctaccacttcaccceigcaggggccccggctgcggg300catccaacgc肌tgfltg肌Caac犯cgaxxtcgtgagg犯gag卿gctggcagacttga360ccgggcccatcattcccaagtgccggagtggcatctagtgtgtgcgggtgctgaccacgc420ctttgaactggacgtgtcctactgat犯gctgtgctctgcagtgg犯accgg犯ggcaaa■gtgccggcac3g3CCCtgCtgtggttcagttctttatgcactaaggttttaggttagcta540gtggttgtagttgaaactttggtt城gtgaagtttttctttagtcacag600犯gttCELgtCtggttattat11aaaaactaagaagcccctgaaccagcagatcttactga660agacgatatttgacttaccccctggagccccgtttgggtggccttgctgt720gtggtgUtcaggtgcatt739权利要求1、一种与猪肉质性状相关的分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，序列表SEQIDNO:1的第134位碱基处有一个A134-G134的碱基突变，导致RFLP-MraI多态性。3、检测如权利要求2所述碱基突变的引物对的DNA序列如下所示-正向5，AGTTCAGCATCGTGGGGACA3'，反向5，AATGCACCTGAAACACCACACAG3，。4、一种如权利要求1或2所述的分子标记的制备方法，其特征按照以下步骤用人TMOi)7基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性90%以上的表迖序列标签(EST);然后对EST进行拼接；根据与人7^fOD7基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，设计扩增引物，提取DNA，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。5、权利要求1或2所述的分子标记在猪分子标记辅助选择中的应用。全文摘要本发明属于家畜基因工程分子标记制备领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择关联分析应用的与猪肉质性状相关的分子标记的克隆及应用。所述的分子标记由人TMOD1基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。序列表SEQIDNO1所示序列的第134位碱基处有一个A134-G134的碱基突变，导致RFLP-MvaI多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测方法的应用，为猪的标记辅助选择的关联分析提供了一个新的分子标记。文档编号C12Q1/68GK101358244SQ20081019705公开日2009年2月4日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者梅余,榜刘,辉吴,朱猛进,李长春,斌樊,赵书红申请人:华中农业大学