专利名称：犬S100β蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种犬siooe蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。
背景技术：
S100蛋白家族是广泛分布于不同组织的一类分子量(10-13 kDa)较 小的酸性钙结合蛋白，具有EF手型(螺旋-环-螺旋)钙离子结合区，目 前发现至少包含21个成员。S100e就是S100蛋白家族最经典的一员。
siooe蛋白特异性地存在于脑组织的胶质细胞胞质中，包括星形神经胶 质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等，也存在于神经元的亚群和胶质
以及外周神经系统的雪旺氏细胞(Schwanncell)中。研究显示S100P作 为钙传感器蛋白，具有广泛的生物学活性，如①调节蛋白激酶C和 钙调蛋白的磷酸化及RNA的合成，从而调节细胞的能量代谢；②作为 细胞内正常成分参与细胞内外钙离子水平的调节；③增强ATP酶的活 性；④通过神经胶质细胞的旁分泌和自分泌，作用于神经元和神经胶质 细胞，从而促进神经的生长和损伤后修复；⑤激活脑果糖1, 6 -二磷酸 醛缩酶和葡萄糖磷酸变位酶，促进神经的生长和损伤后的修复；⑥作用
于光感受器外膜上的鸟苷酸环化酶。由此可见，siooe在细胞内和细胞
外都具有广泛的生物学效应。市场上多是针对人、小鼠及大鼠S100I3的 抗体，这些抗体与牛、羊、猪、兔、猫、猴等有一定的交叉反应，但针对犬的S100(3蛋白高特异性、高滴度的抗体目前还没有。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法易操作，能制备出抗犬siooe蛋
白抗体的犬siooe蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法。
本发明的技术解决方案是
一种犬S1OO0蛋白的体外表达方法，其特征是包括下列步骤
1) 取正常毕格犬坐骨神经，用Trizol试剂提取坐骨神经总RNA;
2) RT-PCR扩增用逆转录试剂盒及总RNA进行逆转录反应，合 成cDNA第一链，再以合成的cDNA为模板，进行犬S100 3基因的PCR 扩增；
3) 连接用克隆载体试剂盒，将PCR产物连接到克隆载体中；
4) 犬S100P cDNA序列的测定将己克隆在克隆载体中的S100 3 cDNA进行测序，测序结果其序列与基因库中的序列完全一致；
5) 设计S100e表达载体的引物，构建S100P重组原核表达质粒 以上述测序正确的质粒为模板，PCR扩增SIOOP基因片断；用限制性 内切酶屈o I 、 SamH I消化S100 3的PCR产物和PGEX-4T-1质粒 载体，并进行酶切产物的胶回收；用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收 产物和PGEX-4T-1质粒载体酶切回收产物连接；
6) 感受态细胞的制备及重组质粒的转化用无菌接种棒从感受态 细胞菌株蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37C培养过夜后挑取单个 克隆接种于5mlLB培养基中，细菌培养摇床中37。C、 200转/分震荡培 养20小时；取0.5ml该菌液接种于无氨节青霉素100ml LB液体培养基中，37。C振荡培养2-2.5小时，至OD6o。为0.4-0.5时，放置于4。C冰箱 冷却l-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4"C离心，4000gxl0 分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；再4。C离 心，4000gxl0分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液lml 悬浮。以100^1/管分装入1.5ml离心管中，-70卩冻存备用；取5filDNA 连接产物加入lOOpl感受态细胞中，旋转使DNA分散均匀，冰浴30分 钟，42。C水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基20(^1， 于37t:缓摇孵育45分钟，将培养物涂于1.5%含氨节青霉素的琼脂LB 平板，待胶表面没有液体流动时，37'C温箱倒置培养12-16小时；
7) 、重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接 种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37C震荡培养过夜，以碱裂解 法提取质粒DNA，限制性内切酶消化l小时，电泳鉴定DNA目的片断 是否正确构建于表达载体中；
8) 用鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞，挑取含重组质粒的菌 体单斑至2ml LB培养基中37"C振荡培养过夜，其中LB培养基中含氨 苄青霉素量为50mg/L;将lml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml 培养瓶中，37'C振荡培养至OD,为0.6，取lml菌液作为未诱导的对 照组，余下菌液中加入异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度分 别为0. 1 mmol/L， 37"C诱导4小时；同时以转化了 pGEX-4T-l载体的 感受态细胞作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX-4T-l载体的BL21 菌液菌液各lml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01MPBS 500W 重悬，加入等体积2 x SDS电泳上样缓冲液，10(TC煮沸5分钟，然后胶中各加入20ix 1悬 液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况。 感受态细胞为DH5 a或BL21 。
一种犬S100e蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征是包括下
列步骤
将20ml转化了 pGEX-4T-S100P的感受态细胞接种到1000ml LB培 养基中进行扩大培养，37"C震荡培养至0De。。为0.6左右，加入异丙基 - 3 -D-硫代半乳糖苷至终浓度为0. 1 mmol/L， 37。C诱导4小时，菌液 离心，超声破碎后，吸附、洗脱GST-SIOOP融合蛋白；将洗脱液放入预 处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4"C透析24小时，收集透析 后的液体;用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-S100 3融合蛋白；收集上述蛋白质后，第一次用弗氏完全佐剂与抗原乳化后 免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐剂与抗原乳化后加强免疫，4次免 疫后，兔放血，收集抗血清；其中转化了pGEX-4T-S100e的感受态细胞
的制备方法与犬sioo e蛋白的体外表达方法中相同。
吸附、洗脱GST-S1OO0融合蛋白的具体方法是用GE healthcare 公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 0融合蛋白，再用10 mM 的还原型GSH洗脱glutathione s印harose。
本发明所述制备的抗体，包括在兔、羊、鼠等动物体内制备相应动
物来源的抗犬siooe蛋白多克隆抗体，这些多克隆抗体在体内外均可 特异性的与犬sioo e蛋白相结合。
本发明的优越性在于以PGEX-4T-1为基础所构建的体外S100e表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行 纯化，可方便地获得大量的GST-S100e融合蛋白。另外，经此蛋白免
疫大耳兔所制备的兔抗犬siooe血清滴度高、特异好，完全可以满足
相关实验的需要。
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下面结合附图和实施例对本发明作迸一步说明。
图1是目的基因S1003的测序结果示图。
图2是原核表达质粒pGEX-4T-S100e构建示图。
图3是细菌裂解产物电泳后考马斯亮蓝染色结果示图。
图4是GST-S100P融合蛋白经glutathione sepharose纯化后电泳示图。
图5是制备的抗体与细菌表达的S100P融合蛋白Western Blot结果示图。
图6是制备的抗体与犬坐骨神经中的S100p蛋白Western Blot结果示图。
图7是制备的抗体与犬坐骨神经中的S100P蛋白免疫组化结果示图。
具体实施例方式
实施例1:
一种犬SIOOP蛋白的体外表达方法，包括下列步骤
步骤1)、取正常毕格犬坐骨神经，用Trizol试剂提取坐骨神经总步骤2)、RT-PCR扩增用Qiagen公司逆转录试剂盒及2 u g总RNA 进行逆转录反应，合成cDNA第一链，再以合成的cDNA为模板，进行 犬S100 3基因的PCR扩增；
步骤3)、连接用Promega公司的pGEM-T Vector试剂盒，将PCR 产物连接到克隆载体pGEM-T Vector中；
步骤4)、犬3 cDNA序列的测定将已克隆在克隆载体 pGEM-T Vector中的S100e cDNA进行测序，测序结果其序列与基因 库中的序列完全一致；
1 ATGTCGCAGCTGGAGAAGGCGGCGCTGGCCCTGCTCGACGTGTTCCAGCA 51 GTACTCGGCGCGGGCGGGTGGTGGGCGCAGGCTGAGGAAGGCCGACGTCA
151 CAGGAGGTCGTGGACAAGGTCATGGAGACACTGGACAGTGACGGAGACGG 201 CGAGTGCGACTTCCAGGAGTTCGTGGCCTTCGTGGCTATGGTCACCACCG 251 CCTGCCACGAGTTCTTCGAGCACGAGTGA
步骤5)、设计S100e表达载体的引物，构建S100e重组原核表达 质粒以上述测序正确的质粒为模板，PCR扩增S100e基因片断。用 限制性内切酶，o 1、BawH I消化S100e的PCR产物和PGEX-4T-1 原核表达质粒载体，并进行酶切产物的胶回收。用T4 DNA连接酶将 PCR酶切回收产物和PGEX-4T-1原核表达质粒载体的酶切回收产物连 接；
步骤6)、感受态细胞的制备及重组质粒的转化用无菌接种棒从-70 。C保存的DH5 a菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37°。培 养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于 37°C、 200转/分震荡培养20小时。取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉
10素100ml LB液体培养基中，37。C震荡培养2-2.5小时，至OD,为0.4-0.5 时，放置于4"C冰箱冷却l-2小时。将培养液分入两个50ml离心管中， 4T:离心，4000gxl0分钟，弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl2 25ml悬浮 30分钟。4。C离心，4000gxl0分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1MCaCl2-甘油溶液lml悬浮。以10(Hd/管分装入1.5ml离心管中，-7(TC冻存备用。 取5|Lil DNA连接产物加入10(^1感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA 分散均匀，冰浴30分钟，42。C水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟 后加入LB培养基200)Li1，于37t:缓摇孵育45分钟，将培养物适量涂于 1.5%琼脂LB平板(含氨苄青霉素)，待胶表面没有液体流动时，37°C 温箱倒置培养12-16小时；
步骤7)、重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个 克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37匸震荡培养过夜，以 碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA 目的片断是否正确构建于表达载体中；
步骤8)、目的蛋白的表达BL21感受态细胞的制备(方法同上述 DH5a感受态细胞的制备)。用鉴定正确的pGEX-4T-S100e重组质粒 转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基 (含氨苄青霉素50mg/L)中37'C震荡培养过夜。将lml菌液加入到含 50mlLB培养基的1000ml培养瓶中，37"震荡培养至OD6(X)为0.6左右， 取lml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-(3-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)至终浓度为O. 1 mmol/L， 37'C诱导4小时。同时以转 化了 pGEX-4T-l载体的BL21细菌作阴性对照。将诱导、末诱导的pGEX-4T-l载体的BL21菌液各lml，室温lOOOOg离心1分钟，弃去上 清，0.01MPBS 500jil重悬，加入等体积2xSDS电泳上样缓冲液，100 。C煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝 胶中各加入20iU悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检 测融合蛋白表达情况。 实施例2:
一种犬S100P蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤在 经实施例1步骤，证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了 pGEX-4T-S100 3的BL21细菌接种到1000mlLB培养基中进行扩大培养，37"C震荡培 养至OD6oc为0.6左右，加入异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓 度为0. 1 mmol/L， 37匸诱导4小时。菌液离心，超声破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST-S100P融合蛋白。用 10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose，将洗脱液放入预处理 的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4"C透析24小时，收集透析后的 液体。用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-S100 P融合蛋白。参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白 质的浓度。收集足够量的蛋白质后，第一次用弗氏完全佐剂与抗原乳化 后免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐剂与抗原乳化后加强免疫，4次 免疫后，兔放血，收集抗血清。利用protein G法纯化抗血清，并利用 ELISA方法确定纯化后抗体的滴度。再用纯化后的抗体对细菌目的蛋白 条带和动物组织中的S100P蛋白进行检测，确定抗体的特异性。
结果1、目的蛋白获得了高效的表达。2、以Western方法证明获得的抗体能识别细菌表达的和犬坐骨神经中的S100e蛋白。3、以免疫 组化的方法证明得到的抗体能有效地识别犬坐骨神经中的S100P蛋白。 (见图5、图6、图7)。
权利要求
1、一种犬S100β蛋白的体外表达方法，其特征是包括下列步骤1)取正常毕格犬坐骨神经，用Trizol试剂提取坐骨神经总RNA；2)RT-PCR扩增用逆转录试剂盒及总RNA进行逆转录反应，合成cDNA第一链，再以合成的cDNA为模板，进行犬S100β基因的PCR扩增；3)连接用克隆载体试剂盒，将PCR产物连接到克隆载体中；4)犬S100βcDNA序列的测定将已克隆在克隆载体中的S100β cDNA进行测序，测序结果其序列与基因库中的序列完全一致；5)设计S100β表达载体的引物，构建S100β重组原核表达质粒以上述测序正确的质粒为模板，PCR扩增S100β基因片断；用限制性内切酶Xho I、BamH I消化S100β的PCR产物和PGEX-4T-1质粒载体，并进行酶切产物的胶回收；用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和PGEX-4T-1质粒载体酶切回收产物连接；6)感受态细胞的制备及重组质粒的转化用无菌接种棒从感受态细胞菌株蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，细菌培养摇床中37℃、200转/分震荡培养20小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5小时，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；再4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用；取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，旋转使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2-3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃缓摇孵育45分钟，将培养物涂于1.5％含氨苄青霉素的琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16小时；7)、重组克隆的筛选及酶切鉴定从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；8)用鉴定正确的重组质粒转化感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基中37℃振荡培养过夜，其中LB培养基中含氨苄青霉素量为50mg/L；将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃振荡培养至OD600为0.6，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.1mmol/L，37℃诱导4小时；同时以转化了pGEX-4T-1载体的感受态细胞作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX-4T-1载体的BL21菌液菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500μl重悬，加入等体积2×SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12％SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况。
2、根据权利要求l所述的犬S100e蛋白的体外表达方法，其特征 是感受态细胞为DH5a或BL21。
3、 一种犬S100 3蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征是包括 下列步骤将20ml转化了 pGEX-4T-S100 g的感受态细胞接种到1000ml LB培 养基中进行扩大培养，37t:震荡培养至OD咖为0.6左右，加入异丙基 -e-D-硫代半乳糖苷至终浓度为O. 1 ranol/L， 37。C诱导4小时，菌液 离心，超声破碎后，吸附、洗脱GST-S1OO0融合蛋白；将洗脱液放入预 处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4。C透析24小时，收集透析 后的液体;用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST-S100 P融合蛋白；收集上述蛋白质后，第一次用弗氏完全佐剂与抗原乳化后 免疫大耳兔，3周后用弗氏不完全佐剂与抗原乳化后加强免疫，4次免 疫后，兔放血，收集抗血清；其中转化了pGEX-4T-S100P的感受态细胞的制备方法与犬siooe蛋白的体外表达方法中相同。
4、 根据权利要求3所述的犬siooe蛋白的多克隆抗体的制备方法，其特征是吸附、洗脱GST-S100e融合蛋白的具体方法是用GE healthcare公司的glutathione s印harose吸附GST-S100 P融合蛋白， 再用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione s印harose。
全文摘要
本发明公开了一种犬S100β蛋白的体外表达及其多克隆抗体的制备方法，包括提取犬坐骨神经总RNA、RT-PCR扩增、连接、犬S100βcDNA序列的测定、设计S100β表达载体的引物构建S100β重组原核表达质粒、感受态细胞的制备及重组质粒的转化、重组克隆的筛选及酶切鉴定、目的蛋白的表达及多克隆抗体制备等步骤。本发明以PGEX-4T-1为基础所构建的体外S100β表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行纯化，可方便地获得大量的GST-S100β融合蛋白。另外，经此蛋白免疫大耳兔所制备的兔抗犬S100β血清滴度高、特异好，完全可以满足相关实验的需要。
文档编号C12N15/12GK101451136SQ20081019669
公开日2009年6月10日 申请日期2008年9月17日 优先权日2008年9月17日
发明者斐 丁, 梅 刘, 炎 刘, 坚 吴, 蒋茂荣, 顾晓松 申请人:南通大学