专利名称：一枝蒿多倍体的诱导方法
技术领域：
本发明涉及药用植物育种领域，具体地说，涉及维吾尔药一枝蒿 的多倍体诱导方法。
背景技术：
新疆一枝蒿是菊科蒿属植物岩蒿"rfe/w'sis TY^e^r" L.)的 全草，维吾尔医常用药材，主要分布在天山、阿尔泰山海拔2000-4000 米的沙质高山草甸的松林边开阔地。多年生，高20-50 cm，根茎横生， 黄褐色，通常一至数枝斜上，不分枝，紫红或微绿色；叶互生，侧卵 形；头状花序，俯生，密集于茎的上部，白色；生于林缘、路旁、屋 边及山坡向阳草地，喜凉爽、湿润、土壤疏松的环境；以干燥、完整、 无根、无杂质者最好。气味芳香，味微苦，药用全草，含黄酮甙、树 脂氨基酸、挥发油、生物碱等成分。具有活血、抗过敏、清热解毒、 消食健胃、镇静镇吐等功能。主要用于治疗各种感冒、急慢性扁桃体 炎、荨麻疹、消化不良、胃疼胃胀、跌打红肿、慢性肾炎和钩端螺旋 体病等。其中对感冒和肝炎的疗效更为显著。随着国家对中药材的保 护力度加大，近年来倍受人们的关注。一枝蒿全世界约有400多种，我国约占二分之一，新疆约有70多 种，贮量十分丰富，是新疆哈萨克和蒙古族牧民家庭常备中草药。新 疆西域药物有限公司开发出全疆知名的药物——复方一枝蒿颗粒，对 治疗伤风感冒效果甚好。新疆一枝蒿已成为新疆一种重要的中草药及 经济创收作物。因此，为人工种植提供优质的新疆一枝蒿种苗就尤为 迫切，为了避免新疆一枝蒿品种退化问题，加大新疆一枝蒿的品种选 育也是当务之急。
本发明是在ZL2008100728390的基础上进一步研究，结合一枝蒿 的组织培养和快速繁殖方法，利用秋水仙素处理茎段使再生植株染色 体加倍，诱导产生多倍体新疆一枝蒿植株，通过改变染色体倍性使植 株产生优良性状以提高其药材产量及药用成分的含量，克服新疆一枝 蒿在长期种植中出现品种退化问题。这对扩大新疆特有经济类作物种 植面积，提高一枝蒿种植收入，推广常用中药开发利用有重要意义。发明内容本发明目的在于，在ZL2008100728390的基础上进一步研究，结 合一枝蒿的组织培养和快速繁殖方法，提供一种一枝蒿多倍体的诱导 方法，是在离体培养下，诱导新疆一枝蒿多倍体的方法，该方法提供 了多倍体诱导有效的秋水仙素浓度和处理时间组合、形态学鉴定方 法、染色体压片方法和气孔鉴定方法。通过本发明可以有效地诱导和 筛选出新疆一枝蒿多倍体，有助于克服新疆一枝蒿在长期种植中出现 的品种退化问题，对扩大特有经济类作物种植面积、提高新疆一枝蒿 种植收入和推广常用中药开发利用有重要意义。发明所述的一种一枝蒿多倍体诱导方法，按下列步骤进行a、 切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段接种到芽增殖培 养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧芽的萌发，置于 温度25"C，光照强度2000 lx，光照时间16 h/d进行培养4 d;b、 将步骤a中培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和0—2000 mg/L秋水仙素的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡10 — 75 h;c、 将步骤b中茎段分别用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸 上晾干3 min后转入芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NAA 0. 05 mg/L 中培养30 d;d、 将步骤c中的茎段上长大的侧芽切下，再转接到MS培养基中 诱导生根；e、 一枝蒿多倍体筛选按常规的形态学筛选方法确定疑似株；f、 一枝蒿多倍体鉴定取疑似株幼嫩根尖或茎尖组织，经过8-
羟基喹啉预处理1-6 h，卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸6(TC解 离5 — 12min，改良苯酚品红染色液染色30 min，压片观察统计根尖 或茎尖染色体，确定多倍体植株。步骤b中秋水仙素的浓度优选500-2000 mg/L。步骤b中摇床上浸泡优选时间为18-72 h。步骤f中8-羟基喹啉优选预处理时间为3-6 h。步骤f中盐酸优选解离时间为7—9 min。本发明所述一枝蒿多倍体诱导方法优点在于诱导材料的选择。本发明采用一枝蒿的茎段为诱导对象，茎段上 有很多侧芽生长点，结合ZL2008100728390的一枝蒿的组织培养和快 速繁殖方法，可以在一定时间内再生出大量变异的侧芽。诱导方法的选择。本发明以附加2%二甲基亚砜及不同浓度秋水 仙素诱导侧芽染色体多倍化，利于秋水仙素渗透入侧芽发挥诱变作 用，诱变处理后采用水洗，释放吸附在表面的秋水仙素，降低了秋水 仙素对幼嫩组织的毒害作用，可以提高诱变后侧芽的成活率。
图1为本发明茎段外植体图(标尺为lcm)图2为本发明二倍体(A、 C和F)与多倍体(B、 D和E)形态学 比较图(标尺为lcm)图3为本发明二倍体(A)与多倍体(B)气孔比较图(标尺为25Mm) 图4为本发明二倍体染色体(A) (2n=2x=48)与四倍体染色体 (B) (2r^4x^36)图(标尺为5Mm)具体实施方式
实施例1:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成1.5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx,光照时间为16 h/d进行培养4 d;
将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡12 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理1 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸60。C解离8 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，无多倍体出 现。外植体存活率可以达到72.7%，多倍体诱变率为0%(诱变率 多倍体数/增殖的芽数)。实施例2:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 0 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡24 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理3 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸6(TC解离9 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，无多倍体出 现。外植体存活率可以达到90%,多倍体诱变率为0%(诱变率多 倍体数/增殖的芽数)。实施例3:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约0. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6—BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧
芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx,光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡48 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸60。C解离9 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，无多倍体出 现。外植体存活率可以达到100%，多倍体诱变率为0%(诱变率多 倍体数/增殖的芽数)。实施例4:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡72 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h， 卡诺固定液固定24h， lmol/L盐酸60。C解离6 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，无多倍体出 现。外植体存活率可以达到72.7%，多倍体诱变率为0%(诱变率 多倍体数/增殖的芽数)。实施例5:
切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素500 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡10 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干4 min后 转入芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NAA 0. 05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；一枝蒿多倍体筛选按常规的形态学筛选方法确定疑似株，根据 二倍体与秋水仙素处理后再生植株在叶片大小、叶片厚度、叶片颜色、 茎的粗壮、根的粗壮、气孔大小及密度等方面的差异确定疑似株；一枝蒿多倍体鉴定取疑似株幼嫩根尖或茎尖组织，经0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理2 h，卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸 6(TC解离8min，改良苯酚品红染色液染色30 min，压片观察统计根 尖或茎尖染色体，确定多倍体植株，经500 mg/L秋水仙素处理12 h 外植体存活率可以达到80%，多倍体诱变率为0%(诱变率多倍体 数/增殖的芽数)。实施例6:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 0 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素550 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡36 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理6 h，
卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸60。C解离9 min，改良苯酚品红 染色液染30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，确定多倍体植 株，经550 mg/L秋水仙素处理36 h外植体存活率可以达到58. 3%， 多倍体诱变率为4. 8% (诱变率多倍体数/增殖的芽数)。 实施例7:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NAA 0. 05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素700 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡48 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸60。C解离9 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，确定多倍体 植株，经700 mg/L秋水仙素处理48 h外植体存活率可以达到40%， 多倍体诱变率为5. 9% (诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例8:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25'C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素800 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡72 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;
将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸6(TC解离9 min，改良苯酚品红 染色液染色30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，确定多倍体 植株，经800 mg/L秋水仙素处理72 h外植体存活率可以达到30%， 多倍体诱变率为0%(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例9:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素1000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡12 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干4 min后 转入芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NAA 0. 05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；一枝蒿多倍体筛选按常规的形态学筛选方法确定疑似株，根据二倍体与秋水仙素处理后再生植株在叶片大小、叶片厚度、叶片颜色、 茎的粗壮、根的粗壮、气孔大小及密度等方面的差异确定疑似株-，一枝蒿多倍体鉴定取疑似株幼嫩根尖或茎尖组织，经0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h，卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸 6(TC解离8min，改良苯酚品红染色液染色30 min，压片观察统计根 尖或茎尖染色体，确定多倍体植株，经1000 mg/L秋水仙素处理12 h 外植体存活率可以达到60%，多倍体诱变率为9. 1%(诱变率多倍 体数/增殖的芽数)。实施例10:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧
芽的萌发，置于温度为25'C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素1000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡24 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理6 h， 卡诺固定液固定24h， lmol/L盐酸60'C解离10min，改良苯酚品红 染色液染30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经1000 mg/L 秋水仙素处理24 h外植体存活率可以达到53. 8%，多倍体诱变率为 5.6%(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例11:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素1000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡48 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理4 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸60'C解离9 min，改良苯酚品红 染色液染色30min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经1000 mg/L 秋水仙素处理48 h外植体存活率可以达到50% ，多倍体诱变率为7. 7 %(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例12:
切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25'C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素1500 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡75 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理5 h， 卡诺固定液固定24h， lmol/L盐酸60。C解离12min，改良苯酚品红 染色液染色30min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经1500 mg/L 秋水仙素处理75 h外植体存活率可以达到30Q/^，多倍体诱变率为O %(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例13:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约0. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素2000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡10 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干4 min后 转入芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NM 0. 05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；一枝蒿多倍体筛选按常规的形态学筛选方法确定疑似株，根据二倍体与秋水仙素处理后再生植株在叶片大小、叶片厚度、叶片颜色、茎的粗壮、根的粗壮、气孔大小及密度等方面的差异确定疑似株；一枝蒿多倍体鉴定取疑似株幼嫩根尖或茎尖组织，经0.002 mol/L 8-羟基喹啉预处理3 h，卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸6(TC解离7min,改良苯酚品红染色液染色30 min,压片观察统计根 尖或茎尖染色体，确定多倍体植株，经2000 mg/L秋水仙素处理10 h 外植体存活率可以达到45.5%，多倍体诱变率为20%(诱变率多倍 体数/增殖的芽数)。 实施例14:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约l.Ocm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素1800 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡24 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理6 h， 卡诺固定液固定24 h， lmol/L盐酸6(TC解离9 min，改良苯酚品红 染色液染30 min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经1800 mg/L 秋水仙素处理24 h外植体存活率可以达到40%，多倍体诱变率为 27.3%(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例15:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 0 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25t:，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素2000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡48 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;
将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理2 h， 卡诺固定液固定24h， lmol/L盐酸60。C解离10min，改良苯酚品红 染色液染色30min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经2000 mg/L 秋水仙素处理48 h外植体存活率可以达到40%，多倍体诱变率为 16.7%(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。实施例16:切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段切成约1. 5 cm长度， 接种到芽增殖培养基MS+6-BA 1. 0 mg/L + NAA 0. 05 mg/L上启动侧 芽的萌发，置于温度为25°C ，光照强度为2000 lx，光照时间为16 h/d进行培养4 d;将培养的茎段浸泡在含有2%二甲基亚砜和秋水仙素2000 mg/L 的溶液中，置于转速为50 r/min摇床上浸泡72 h;将茎段用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3 min后转 入芽增殖培养基MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.05 mg/L中培养30 d;将茎段上的侧芽切下，转接到MS培养基中诱导生根；植株幼嫩根尖或茎尖组织经0. 002 mol/L 8-羟基喹啉预处理6 h， 卡诺固定液固定24h， lmol/L盐酸6(TC解离12 min，改良苯酚品红 染色液染色30min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，经2000 mg/L 秋水仙素处理72 h外植体存活率可以达到18. 2%，多倍体诱变率为 0%(诱变率多倍体数/增殖的芽数)。
权利要求
1、一种一枝蒿多倍体诱导方法，其特征在于按下列步骤进行a、切除一枝蒿无菌苗的叶片和根，剩下的茎段接种到芽增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L上启动侧芽的萌发，置于温度25℃，光照强度20001x，光照时间16h/d进行培养4d；b、将步骤a中培养的茎段浸泡在含有2％二甲基亚砜和0—2000mg/L秋水仙素的溶液中，置于转速为50r/min摇床上浸泡10—75h；c、将步骤b中茎段分别用无菌水冲洗3次后，放在无菌的滤纸上晾干3min后转入芽增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L中培养30d；d、将步骤c中的茎段上长大的侧芽切下，再转接到MS培养基中诱导生根；e、一枝蒿多倍体筛选按常规的形态学筛选方法确定疑似株；f、一枝蒿多倍体鉴定取疑似株幼嫩根尖或茎尖组织，经过8-羟基喹啉预处理1-6h，卡诺固定液固定24h，1mol/L盐酸60℃解离5—12min，改良苯酚品红染色液染色30min，压片观察统计根尖或茎尖染色体，确定多倍体植株。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中秋水仙素 的浓度优选500-2000 mg/L。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中摇床上浸 泡优选时间为18-72 h。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f中8-羟基喹 啉优选预处理时间为3-6 h。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤f中盐酸优选 解离时间为7_9 min。
全文摘要
本发明涉及一种一枝蒿多倍体的诱导方法，是在离体培养下诱导一枝蒿多倍体的方法，该方法提供了多倍体诱导有效的秋水仙素浓度和处理时间组合、形态学鉴定方法、染色体压片方法和气孔鉴定方法。通过本发明可以有效地诱导和筛选出新疆一枝蒿多倍体，有助于克服新疆一枝蒿在长期种植中出现的品种退化问题，对扩大新疆特有经济类作物种植面积、提高新疆一枝蒿种植收入和推广常用中药开发利用有重要意义。
文档编号A01H4/00GK101396001SQ20081007297
公开日2009年4月1日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者敏 刘, 唐晓义, 康喜亮, 琴 徐, 波拉提, 王晓军, 郝秀英 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所