一种多倍体大花萱草组培方法及培养基的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种多倍体大花萱草组培方法，同时还公开了适用于本发明组培方法的培养基，本发明方法提高了多倍体大花萱草的繁殖系数，弥补了传统组织培养技术的一些不足，如降低了外植体的污染率、提高了愈伤组织分化率和移栽成活率等。通过外植体采集、外植体消毒效果、生根效果、移栽苗成活率等方面均优于以往萱草品种的组培快繁技术，所建立的规模化商品生产体系稳定，生产周期只需2个月左右。加快多倍体大花萱草繁殖速度，打破繁殖的季节限制，实现育苗工厂化生产。本发明的组培配方是多倍体大花萱草大量扩繁的最佳组合，可以快速大量的繁殖组培苗，适应园林绿化市场需求。
【专利说明】一种多倍体大花萱草组培方法及培养基
【技术领域】
[0001]本发明提供一种多倍体大花萱草组培方法，同时还公开了适用于本发明组培方法的培养基，属于花卉培育【技术领域】。
【背景技术】
[0002]萱草为多年生宿根花卉，近几年广泛用于城市绿化和园林景观建设中。在众多萱草品种中，多倍体大花萱草花色丰富，花姿优美，且叶色翠绿，具备栽培简易，春季萌发早等栽培优势。近年来市场对多倍体大花萱草的需求量越来越大，单纯的分株繁殖速度，远不能满足商品化生产的需要，从而限制了多倍体大花萱草在园林中的大量应用。因此，探索出多倍体大花萱草快速繁殖的技术和方法，开展组织培养的研究及加速其推广应用就显得至关重要。
【发明内容】
[0003]本发明提供一种多倍体大花萱草组培方法，解决多倍体大花萱草外植体选择、夕卜植体采集时间、外植体消毒方法、培养基配方、炼苗方法等方面的技术难点。
[0004]本发明还公开了适用于本发明组培方法的多种培养基，可以快速大量繁殖的多倍体大花萱草，弥补传统技术的外植体污染率高、分化率低、移栽成活率低等问题，移栽成活率可达95%。
[0005]本发明公开的多倍体大花萱草组培方法，包括以下步骤:
1)在植株抽蕾期，采集健壮的无病虫害的嫩叶、生长点、腋芽、花蕾、花瓣、花梗，作为组织培养的外植体，将采集 到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精消毒5-30s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用0.1% (质量百分比)升萊消毒5-20min ；
2)将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，送入培养室进行无菌培养，培养基为MS1L+NAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+2, 4_D 0.7mg/L+ 鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ;将分化后的外植体转移到继代增殖培养基上进行继代培养，得到分化苗，继代培养基为MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+ 鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ；
3)将分化苗接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，壮苗培养基为MS1L+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.04mg/L+马铃薯20g/L+蔗糖3 mg/L、琼脂9 mg/L ;然后，将健壮的瓶苗转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为MS 1L+NAA 0.02mg/L+蔗糖3 mg/L、琼脂9 mg/L；
4)把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，将根部置于盛满水的容器中，置于炼苗室锻炼3-5天，然后移栽到腐殖土:珍珠岩=1:1的基质中，得到成品。
[0006]所述MS培养基的工作液浓度单位为mg/L，含:
大量元素:NH4NO3 1650、KNO3 1900、CaCl2.2H20 440、MgSO4.7H20 370、KH2PO4 170 ；
微量元素:KI 0.83、H3BO3 6.2、MnSO4.4H20 22.3、ZnSO4.7H20 8.6、Na2MnO4.2H20
0.25、CuSO4.5H20 0.0025、CoCl2.6H20 0.0025 ;铁盐=FeSO4.7H20 27.8、Na2-EDTA.2H2037.3 ；
肌醇100、盐酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2.0。
[0007]本发明公开的多倍体大花萱草组培用诱导培养基，其特征在于是由以下原料制成的:
MS 1L、萘乙酸0.2mg/L、6-节基嘌呤0.5mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸0.7mg/L、鹿糖3 mg/L、琼脂 9 mg/L ;pH 值 5.8-6.0。
[0008]本发明公开的多倍体大花萱草组培用继代增殖培养基:其特征在于是由以下原料制成的:
MS 1L、萘乙酸 0.2mg/L、6-节基嘌呤 2.0mg/L、鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ；pH 值
5.8-6.00
[0009]本发明公开的多倍体大花萱草组培用壮苗培养基；其特征在于是由以下原料制成的:
MS 11 、6-苄基嘌呤0.2 mg/L、吲哚-3-丁酸 0.04mg/L、马铃薯 20g/L、蔗糖 3 mg/L、琼月旨 9 mg/L 巾!1值5.8-6.0。
[0010]本发明公开的多倍体大花萱草组培用生根培养基；其特征在于是由以下原料制成的:
MS 1L、萘乙酸 0.02mg/L、蔗糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ;pH 值 5.8-6.0。
[0011 ] 所述MS的工作液浓度单位为mg/L，含:
大量元素:NH4NO3 1650、KNO3 1900、CaCl2.2H20 440、MgSO4.7H20 370、KH2PO4 170 ；
微量元素:KI 0.83、H3BO3 6.2、MnSO4.4H20 22.3、ZnSO4.7H20 8.6、Na2MnO4.2H20
0.25、CuSO4.5H20 0.0025、CoCl2.6H20 0.0025 ;铁盐=FeSO4.7H20 27.8、Na2-EDTA.2H2037.3 ；
肌醇100、盐酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2.0。
[0012]本发明相对于现有技术具有的优点和进步在于:
本发明方法提高了多倍体大花萱草的繁殖系数，弥补了传统组织培养技术的一些不足，如降低了外植体的污染率、提高了愈伤组织分化率和移栽成活率等。通过外植体采集、外植体消毒效果、生根效果、移栽苗成活率等方面均优于以往萱草品种的组培快繁技术，所建立的规模化商品生产体系稳定，生产周期只需2个月左右。加快多倍体大花萱草繁殖速度，打破繁殖的季节限制，实现育苗工厂化生产。本发明的组培配方是多倍体大花萱草大量扩繁的最佳组合，可以快速大量的繁殖组培苗，适应园林绿化市场需求。
【具体实施方式】
[0013]通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0014]实施例1 MS的配制:
工作液浓度单位为mg/L，其中:`
大量元素:NH4NO3 1650、KNO3 1900、CaCl2.2H20 440、MgSO4.7H20 370、KH2PO4 170 ；微量元素:KI 0.83、H3BO3 6.2、MnSO4.4H20 22.3、ZnSO4.7H20 8.6、Na2MnO4.2H20 0.25、CuSO4.5Η20 0.0025、CoC12.6Η20 0.0025 ;铁盐:FeS04.7Η20 27.8、Na2_EDTA.2Η20 37.3 ；肌醇100、盐酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2.0。按比例称取上述原料，混合均匀即得MS。
[0015]实施例2多倍体大花萱草组培用诱导培养基
称取实施例1制备的MS IL加入萘乙酸0.2mg/L、6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.7mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L ；pH值5.8-6.0 ;将上述原料，混合均匀即得。
[0016]实施例3继代增殖培养基
称取实施例1制备的MS IL加入萘乙酸0.2mg/L、6-苄基嘌呤2.0mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L ；pH值5.8-6.0 ;将上述原料，混合均匀即得。
[0017]实施例4壮苗培养基
称取实施例1制备的MS IL加入6-苄基嘌呤0.2 mg/L、吲哚-3- 丁酸0.04mg/L、马铃薯20g/L、蔗糖30g/L、琼脂9 g/L ；pH值5.8-6.0 ;将上述原料，混合均匀即得。
[0018]实施例5生根培养基
称取实施例1制备的MS IL加入萘乙酸0.02mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂9 g/L ;pH值
5.8-6.0 ;将上述原料，混合均匀即得。
[0019]实施例6 1、选择在I月中旬(植株抽蕾期)连续3天无雨后对外植体进行采集，可有效降低外植体的污染率。将采集到的外植(花萱草花蕾)体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精消毒5_30s，再用无菌水冲洗3_5遍，之后用0.1% (质量百分比)升汞消毒5-20min ;其中，最佳的外植体灭菌方法:75%酒精10s+0.1%(质量百分比)升萊消毒12min。
[0020]2、将消毒后的外植体接种到诱导培养基(实施例2)上，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件为温度:25土1°C，光照强度:15001x-20001x，光照时间:12h/d。在此过程中根据外植体诱导和分化情况帅选出最适宜的外植体种类和培养基配方。将芽分化明显的接种块转移到继代增殖培养基(实施例3)上，经过30d培养即可增殖1-2倍，得到分化苗。
[0021]3、为了提高了分化苗的质量，提高移栽的成活率，将生长较弱的分化苗接种到壮苗培养基(实施例4)上进行壮苗培养，经过10-20d的培养即可使瓶苗变粗壮。然后，将健壮的瓶苗转移到生根培养基(实施例5)上进行生根培养。
[0022]4、生根培养后要先经过炼苗的过程，然后移栽，才能适应露地栽培的要求。把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，放在盛满水的小盒中，借助橡皮筋固定小苗，水面高度以不超过根部为宜，置于炼苗室锻炼3-5天，上罩透明塑料布。然后移栽到腐殖土:珍珠岩=1: I的基质中。移栽成活率达96%左右。
[0023]移栽过程中要注意几点，①借助镊子将小苗根部的土捏实，让根与基质充分接触；②移栽过程中，最好将2-3棵小苗种植在一个穴洞内；③移栽后的小苗要套上带孔的透明塑料袋，一周后去掉；④移栽后每半个月浇一次稀释500倍的MS营养液(不含蔗糖和琼脂的MS培养基)。以上几点均可提高移栽苗成活率。
[0024]实施例7
1、选择在I月中旬(植株抽蕾期)连续3天无雨后对外植体进行采集，可有效降低外植体的污染率。采集健壮的无病虫害的嫩叶、、腋芽、花蕾、花瓣、花梗，作为组织培养的外植体，将采集到的外植(花萱草生长点)体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精消毒5-30s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用0.1% (质量百分比)升汞消毒5-20min ;其中，最佳的外植体灭菌方法:75%酒精lOs+0.1% (质量百分比)升汞消毒 12min。
[0025]2、将消毒后的外植体接种到诱导培养基(实施例2)上，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件为温度:25土1°C，光照强度:15001x-20001x，光照时间:12h/d。在此过程中根据外植体诱导和分化情况帅选出最适宜的外植体种类和培养基配方。将芽分化明显的接种块转移到继代增殖培养基(实施例3)上，经过30d培养即可增殖1-2倍，得到分化苗。
[0026]3、为了提高了分化苗的质量，提高移栽的成活率，将生长较弱的分化苗接种到壮苗培养基(实施例4)上进行壮苗培养，经过10-20d的培养即可使瓶苗变粗壮。然后，将健壮的瓶苗转移到生根培养基(实施例5)上进行生根培养。
[0027]4、生根培养后要先经过炼苗的过程，然后移栽，才能适应露地栽培的要求。把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，放在盛满水的小盒中，借助橡皮筋固定小苗，水面高度以不超过根部为宜，置于炼苗室锻炼3-5天，上罩透明塑料布。然后移栽到腐殖土:珍珠岩=1: I的基质中。移栽成活率达96%左右。
[0028]移栽过程中要注意几点，①借助镊子将小苗根部的土捏实，让根与基质充分接触；②移栽过程中，最好将2-3棵小苗种植在一个穴洞内；③移栽后的小苗要套上带孔的透明塑料袋，一周后去掉；④移栽后每半个月浇一次稀释500倍的MS营养液(不含蔗糖和琼脂的MS培养基)。以上几点均可提高移栽苗成活率。
[0029]实施例8
1、选择在7月中旬(植株抽蕾期)连续3天无雨后对外植体进行采集，可有效降低外植体的污染率。将采集到的.外植(花萱草腋芽)体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精消毒5_30s，再用无菌水冲洗3_5遍，之后用0.1% (质量百分比)升汞消毒5-20min ;其中，最佳的外植体灭菌方法:75%酒精10s+0.1%(质量百分比)升萊消毒12min。
[0030]2、将消毒后的外植体接种到诱导培养基(实施例2)上，送入培养室进行无菌培养，培养室的条件为温度:25土1°C，光照强度:15001x-20001x，光照时间:12h/d。在此过程中根据外植体诱导和分化情况帅选出最适宜的外植体种类和培养基配方。将芽分化明显的接种块转移到继代增殖培养基(实施例3)上，经过30d培养即可增殖1-2倍，得到分化苗。
[0031]3、为了提高了分化苗的质量，提高移栽的成活率，将生长较弱的分化苗接种到壮苗培养基(实施例4)上进行壮苗培养，经过10-20d的培养即可使瓶苗变粗壮。然后，将健壮的瓶苗转移到生根培养基(实施例5)上进行生根培养。
[0032]4、生根培养后要先经过炼苗的过程，然后移栽，才能适应露地栽培的要求。把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，放在盛满水的小盒中，借助橡皮筋固定小苗，水面高度以不超过根部为宜，置于炼苗室锻炼3-5天，上罩透明塑料布。然后移栽到腐殖土:珍珠岩=1: I的基质中。移栽成活率达96%左右。
[0033]移栽过程中要注意几点，①借助镊子将小苗根部的土捏实，让根与基质充分接触；②移栽过程中，最好将2-3棵小苗种植在一个穴洞内；③移栽后的小苗要套上带孔的透明塑料袋，一周后去掉；④移栽后每半个月浇一次稀释500倍的MS营养液(不含蔗糖和琼脂的MS培养基)。以上几点均 可提高移栽苗成活率。
【权利要求】
1.一种多倍体大花萱草组培方法，其特征在于包括以下步骤: 1)在植株抽蕾期，采集健壮的无病虫害的嫩叶、生长点、腋芽、花蕾、花瓣、花梗，作为组织培养的外植体，将采集到的外植体用洗衣粉水清洗干净，再放在流水下冲洗30min，在超净工作台上用75%酒精消毒5-30s，再用无菌水冲洗3-5遍，之后用0.1% (质量百分比)升萊消毒5-20min ； 2)将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，送入培养室进行无菌培养，培养基为MS1L+NAA 0.2mg/L+6-BA 0.5mg/L+2, 4_D 0.7mg/L+ 鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ;将分化后的外植体转移到继代增殖培养基上进行继代培养，得到分化苗，继代培养基为MS+NAA 0.2mg/L+6-BA 2.0mg/L+ 鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ； 3)将分化苗接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，壮苗培养基为MS1L+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.04mg/L+马铃薯20g/L+蔗糖3 mg/L、琼脂9 mg/L ;然后，将健壮的瓶苗转移到生根培养基上进行生根培养，生根培养基为MS 1L+NAA 0.02mg/L+蔗糖3 mg/L、琼脂9 mg/L ； 4)把生根后的组培苗移出培养瓶，借助毛刷洗净根部的培养基，将根部置于盛满水的容器中，置于炼苗室锻炼3-5天，然后移栽到腐殖土:珍珠岩=1:1的基质中，得到成品； 所述MS培养基的工作液浓度单位为mg/L，含:
大量元素:NH4NO3 1650、KNO3 1900、CaCl2.2H20 440、MgSO4.7H20 370、KH2PO4 170 ；
微量元素:KI 0.83、H3BO3 6.2、MnSO4.4H20 22.3、ZnSO4.7H20 8.6、Na2MnO4.2H200.25、CuSO4.5H20 0.0025、CoCl2.6H20 0.0025 ;铁盐=FeSO4.7H20 27.8、Na2-EDTA.2H2037.3 ； 肌醇100、盐酸0.5、盐酸吡哆醇0.5、盐酸硫胺素0.1、甘氨酸2.0。
2.一种多倍体大花萱草组培用诱导培养基，其特征在于是由以下原料制成的: MS 1L、萘乙酸0.2mg/L、6-节基嘌呤0.5mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸0.7mg/L、鹿糖3 mg/L、琼脂 9 mg/L 巾!1值5.8-6.0。
3.一种多倍体大花萱草组培用继代增殖培养基:其特征在于是由以下原料制成的: MS 1L、萘乙酸 0.2mg/L、6-节基嘌呤 2.0mg/L、鹿糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ；pH 值5.8-6.00
4.一种多倍体大花萱草组培用壮苗培养基；其特征在于是由以下原料制成的: MS 11 、6-苄基嘌呤0.2 mg/L、吲哚-3-丁酸 0.04mg/L、马铃薯 20g/L、蔗糖 3 mg/L、琼月旨 9 mg/L 巾!1值5.8-6.0。
5.一种多倍体大花萱草组培用生根培养基；其特征在于是由以下原料制成的:
MS 1L、萘乙酸 0.02mg/L、蔗糖 3 mg/L、琼脂 9 mg/L ；pH 值 5.8-6.0。
【文档编号】A01H4/00GK103430850SQ201310405775
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】温娜, 武术杰, 王丽兰, 高志新, 刘亚亮, 尹立辉, 席应琪, 孟庆明, 谭首创 申请人:中邦园林股份有限公司, 长春大学