专利名称：离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法
技术领域：
本发明涉及组织培养技术领域，尤其是一种离体培养条件下麻风树多倍 体诱导方法。
背景技术：
自然界的植物多数是二倍体(2n=2x)，即其体细胞(2n)核中包含2个相同 的染色体组(x)。但有些物种经过染色体的自然或人工加倍，可形成含有多个 染色体组的新物种，我们称之为多倍体。常见的多倍体有三、四、五、六和 八倍体等，2n分别等于3x、 4x、 5x、 6x和8x。多倍体现象表现为遗传学上近 缘的生物染色体数目彼此成倍数变化关系，这是高等生物中最普遍的特点之 一。多倍体在自然界中分布比较广泛，据统计，在植物界里约有l/2的物种 是多倍体，而禾本科中多倍体几乎占3/4，花卉中多倍体占2/3以上，它们 在植物进化中起了重要的作用。由于许多重要花卉植物均是多倍体，因而， 育种学家自20世纪30年代开始就热衷于花卉多倍体诱导育种的研究。自然界 的多倍体在无性和有性阶段均可产生，无性阶段是体细胞分裂过程中偶然发 生染色体加倍而造成，有性阶段则是由于小孢子母细胞或大孢子母细在减数 分裂过程中不减数产生了2n配子。因此，人为地诱导体细胞不分裂和性细胞 不减数是产生多倍体的有效途径。随着对多倍体产生途径、特征、特性及鉴 定方法等方面更为深入的研究，使多倍体诱导育种在育种领域显示出日益广 阔的应用和发展前景。
秋水仙素诱导花卉多倍体是应用最多的方法之一。用秋水仙素诱导花卉 多倍体的方法有如下几种①浸种法将种子处理数小时至3 d，处理浓度O. 2 % 1. 6%。②浸芽法此法简便，根系不受药液伤害，能正常出土成苗生 长，诱导效果好。如曼陀罗(Datura stramonium L.)、波斯菊(Cosmos bipinnatus Cav.)等均获得较好的结果。百合(Lilium L.)因用鳞片繁殖， 可将鳞片浸于O. 05% 0. 1%的秋水仙素水溶液中，经1 3 h后扦插，可 得四倍体球芽。③滴苗法用滴管将秋水仙素溶液滴在幼苗顶芽处，也可用 脱脂棉球包裹幼芽，或放在子叶之间再滴秋水仙素溶液，使棉花浸湿。此法 比较烦琐，但诱导效果显著，容易出现嵌合体。④涂抹法将一定浓度的秋 水仙素和一定浓度的羊毛脂膏或者琼脂混合，涂抹到植株的生长点，连续处 理3 d，然后用蒸馏水将茎尖冲洗干净。但是此法诱变率较低，容易出现嵌合 体，经过处理的植株死亡率高。选用哪种方法要依品种、处理季节和当时的 气候条件而定。牛维和等对君子兰(Clivia Lindl.)种子进行诱变处理，用 浓度O. 25X的秋水仙素处理36h，所得到的多倍体诱变率为40%。 1934年， 美国Blakeslee与Avery用秋水仙素处理曼陀罗的种子， 一举获得了85%的多 倍体植物。Chen等采用剥去生长点外幼叶后用秋水仙素溶液滴苗或涂抹取得 了明显的效果，剥滴处理诱导变异频率提高到52. 6%，处理效果提高到30. 4 %;剥涂处理变异率提高到60%，处理效果提高到29. 4%。由于植株整体水 平诱导方法简便易于掌握，目前花卉的多倍体诱导主要采用此法，但其诱导 频率低，有时部分植株为嵌合体。
随着生物科学技术的快速发展，通过离体培养诱导多倍体的方法也得到 较多应用，如①胚乳培养通过胚乳培养通常可以得到三倍体植株。我国已 通过培养北橘柚胚乳获得三倍体植株。美国佛州大学也通过培养菠萝橙的胚 乳获得了三倍体植株。②组织培养结合化学诱变把秋水仙素加进组织培养 基中，可以提高诱变多倍体的效率。③细胞杂交在培养单倍体的花粉细胞和 二倍体的叶肉细胞或胚轴体细胞的原生质基础上，再诱导这两类原生质体融 合，然后培养杂种细胞，就可以获得三倍体。这种试验已在柑橘上获得成功。 ④利用诱导愈伤组织获得多倍体植物组织培养和细胞培养工作的广泛开展， 导致了各种愈伤组织的产生。研究证明，这些愈伤组织中常常包含了不同倍 数的多倍体及异倍体的细胞，若将其加以鉴定和分离培养，也是获得多倍体 的有效途径。愈伤组织产生多倍体是因为在愈伤细胞分裂过程中，由于核内 有丝分裂或分裂期间超数染色体增殖所致。王鸿鹤等(1998)以重瓣大岩桐 (Sinningia speciosa)叶片为外植体，经秋水仙素处理得到大量的多倍体植 株。雷家军(1999)采用组织培养并结合秋水仙素诱导多倍体的方法，成功地 获得珍贵野生资源五叶草莓(Fragariapentaphyua A. Los.)的加倍植株。王 利等(2001)在组织培养条件下，对库拉索芦荟(A/oe m L.)用秋水仙素进行 染色体加倍的诱导处理，诱变率达50%。得到了叶片变厚、叶色变深、叶片 变大的四倍体植株。张兴翠等(2000)报道了互叶白干层(Melaleuca leucadendra L.)快速繁殖方法及运用秋水仙素诱导处理培养多倍体的几种 途径。研究结果表明，以白干层幼嫩茎和叶作外植体，利用秋水仙素作诱导 剂，可成功地诱导多倍体植株。但目前还没有关于可再生能源——麻风树的 多倍体育种方式的报道。
发明内容
本发明的目的是提供在培养基中加秋水仙素诱导法在离体组织上诱导细 胞内染色体加倍的一种离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法。 本发明是通过以下技术方案来实现的
一种离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，其特征在于其诱导方法
(1) .将麻风树种子经消毒、漂洗、剥皮后接种在l/2MS+10g/L蔗糖的培
养基上，培养麻风树无菌苗5-7d;
(2) .取上述麻风树无菌苗的叶片及叶柄剪成l-2cm的小段作为外植体，分 别置于秋水仙素含量为O. 05-0. 2%的分化培养基中进行培养，培养温度为24 ±2°C，光强为1600 20001x，光照15-17h/d，培养2-7d以诱导多倍体的发生；
(S).将上述麻风树外植体从含有秋水仙素的分化培养基上转移到单纯的 分化培养基上培养多倍体的再生芽；
(4) .将培养出的麻风树外植体再生芽切下，转移到伸长培养基上进行继续 培养，培养条件为24士2-C，光强为1600 20001x，光照15-17h/d，保留稳定 的变异株；
(5) .将稳定的变异株接种至1/2 MS+0. 3 mg/L NAA+0. 05%活性炭上 诱导生根，植于基质上炼苗，成活后即可移栽到大田。
而且，所述的麻风树种子的消毒、漂洗的条件为75X酒精消毒30s，再 经O. 1^HgCl2消毒6Min，无菌水漂洗4次。
而且，所述的分化培养基的构成为MS+2. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA， 培养基中附加蔗糖30g/kg,琼脂粉6g/kg。
而且，所述的炼苗基质为叶土与菜园土，其中重量配比叶土菜园土=1 :1。
本发明的优点及有益效果是
采用秋水仙素在离体条件下诱导染色体加倍有三个优点 一是容易控制 实验条件和重复实验结果；二是能提高工作效率，即在离体状态下可同时处 理大批组织细胞，从而得到大批染色体加倍的植株；三是可以减少或避免异 倍性细胞嵌合体，即组织培养技术可通过悬浮培养等手段使培养的细胞高度 分散，直至变成单个细胞群，并可克服嵌合体现象。
本发明对于提高麻风树抗逆性具有重要的现实意义，对麻风树的可再生 能源开发具有促进作用。
具体实施例方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是下述实施例是说明 性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
秋水仙素诱导法在离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法步骤如下
1. 麻风树种子经75X酒精消毒30s，再经O. 1XHgCl2消毒6Min，无菌水 漂洗4次，在超净台中用镊子将外种皮剥离掉，将种子接种在l/2MS+10g/L蔗 糖的培养基上，待发芽后备用。
2. 取培养5-7d的麻风树无菌苗的叶片及叶柄，在超净台中用剪刀剪成2cm
的小段作为外植体，分别置于不同秋水仙素配比(0. 05-0. 2%)的分化培养 基(MS+2. 0 mg/L6-BA+0. lmg/LNAA，培养基中附加蔗糖30g/kg,琼脂粉 6g/kg)中进行培养，培养温度为24士2。C，光强为1600 20001x，光照为 16h/d，以诱导多倍体的发生。
3. 将培养2-7d的麻风树外植体从含有秋水仙素的分化培养基上转移到没 有秋水仙素的同样的分化培养基上(MS+2. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA，培 养基中附加蔗糖30g/kg，琼脂粉6g/kg)，培养多倍体的再生芽。
4. 将从秋水仙素处理的麻风树外植体再生芽切下，转移到伸长培养基上 (MS+1. 0 mg / L6-BA+0. 5 mg / L IAA，培养基中附加蔗糖30g/kg，琼脂粉6g/kg) 进行继续培养，培养条件为24士2-C，光强为1600 20001x，光照为16h/d;期 间将没有变异的再生苗遗弃，保留稳定的变异株。
5. 将稳定的变异株接种至1/2 MS+0. 3 mg/L NAA+0. 05%活性炭上 诱导生根。植于叶土菜园土=1 : l的基质上炼苗，成活后即可移栽到大田。
权利要求
1.一种离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，其特征在于其诱导方法的步骤是(1).将麻风树种子经消毒、漂洗、剥皮后接种在1/2MS+10g/L蔗糖的培养基上，培养麻风树无菌苗5-7d；(2).取上述麻风树无菌苗的叶片及叶柄剪成1-2cm的小段作为外植体，分别置于秋水仙素含量为0.05-0.2％的分化培养基中进行培养，培养温度为24±2℃，光强为1600～2000lx，光照15-17h/d，培养2-7d以诱导多倍体的发生；(3).将上述麻风树外植体从含有秋水仙素的分化培养基上转移到单纯的分化培养基上培养多倍体的再生芽；(4).将培养出的麻风树外植体再生芽切下，转移到伸长培养基上进行继续培养，培养条件为24±2℃，光强为1600～2000lx，光照15-17h/d，保留稳定的变异株；(5).将稳定的变异株接种至1/2MS+0.3mg/L NAA+0.05％活性炭上诱导生根，植于基质上炼苗，成活后即可移栽到大田。
2. 根据权利要求1所述的离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，其特 征在于所述的麻风树种子的消毒、漂洗的条件为75%酒精消毒303，再经 0. 1XHgCl2消毒6Min，无菌水漂洗4次。
3. 根据权利要求1所述的离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，其特 征在于所述的分化培养基的构成为MS+2. 0mg/L6-BA+0. 1 mg / L NAA， 培养基中附加蔗糖30g/kg，琼脂粉6g/kg。
4. 根据权利要求l所述的离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，其特征 在于所述的炼苗基质为叶土与菜园土，其中重量配比叶土菜园土=1 : 1。
全文摘要
本发明涉及一种离体培养条件下麻风树多倍体诱导方法，该步骤包括培养麻风树无菌苗、诱导多倍体、培养多倍体的再生芽、保留稳定的变异株并将该变异株在含活性炭的生根培养基上诱导生根，植于基质上炼苗，成活后即可移栽到大田。本发明采用秋水仙素在离体条件下诱导染色体加倍，容易控制实验条件和重复实验结果，提高工作效率，并可得到大批染色体加倍的植株并减少或避免异倍性细胞嵌合体，对于提高麻风树抗逆性具有重要的现实意义，对麻风树的可再生能源开发具有促进作用。
文档编号C12N5/04GK101112172SQ20071005771
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月22日 优先权日2007年6月22日
发明者刘艳军, 张伟玉, 杨恩芹, 杨静慧 申请人:天津农学院