专利名称：利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法，属生物制药工程技术领域。
藏红花(Crocus sativus L)是一种珍贵的中草药，原产于南欧诸国和伊朗等地。由于它对生育环境要求较高，在我国只有新疆、西藏等地有少量栽培。自古以来，在我国主要使用藏红花医治跌打损伤、伤寒、散郁开结、活血化瘀、咳血吐血及脑血管等疾病。近年发现藏红花柱头中含有的藏红花酸(Crocitin)、藏红花醛(safranal)、藏红花素(Crocin)和藏红花苦素(Protocrocin)等物质具有较强的抗癌活性。特别对血癌、乳头癌、扁平细胞瘤和软组织肉瘤等具有较强的抑制作用。其抗癌机制是从DNA和RNA水平抑制细胞蛋白激酶活性和原癌基因的表达，抑制苯并芘和12-0-14酰基磷酮-13乙酸盐(TPA)的遗传毒性。其癌细胞的半致死量为0.8～2.0nmol/L，副作用远远小于维甲酸，因此，藏红花素等物质完全有可能成为理想的抗癌药物之一。
但是，由于藏红花的药用成分主要存在柱头中，而干燥柱头的产量极低(6kg/hm2)，如果进行大量生产，不但需要大面积耕地，也要花费大量劳力。此外，由于藏红花素(Crocin)和藏红花苦素(Picrocrocin)的分子构造非常复杂，很难用化学法人工合成。因此，利用植物细胞培养法生产藏红花素类抗癌药物是解决藏红花供求的有效方法之一。
本发明的目的是提出一种利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法，利用植物细胞培养法生产具有抗癌活性或者治疗心脑血管疾病的药物。
本发明提出的利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法，该方法包括以下步骤1.在常用植物组织培养基中，按每升培养液加入0～10mg/L细胞生长素或0～10mg/L细胞分裂素，再加入20～60g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5～7，加入7～10g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过105～125℃高温，0.1～0.15MPa压力下消毒后，经冷却作成基本培养基；2.将藏红花的叶鞘用70％的乙醇和3％～10％的次氯酸钠消毒后作为外殖体。接种在上述基本培养基上，在20～25℃，黑暗条件下培养20～40天，形成愈伤组织；3.重新配制上述基本培养基，在培养基中加入细胞分裂抑制剂，加入量为10-100mg/L，将上述的第二步诱导出的愈伤组织接种在该培养基上，在20～25℃，避光条件下培养10～20天；4.将第三步的愈伤组织细胞放在上述第一步不加琼脂的基本培养基中，在20～25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养10～20天，培养出悬浮单细胞系；5.将第四步培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板基本培养基上，在20～25℃，避光条件下培养20～30天，形成新的细胞团，然后用染色剂染色后，用高倍显微镜(1600倍)观察其染色体数目，挑选出多倍体细胞系；6.配置基本培养基，并分别加入氨基酸1～100mg/L、诱导子1～100ml/L、代谢前体10～200mg/L、辅酶0.1～10mg/L，将第五步获得的多倍体细胞接种在该培养基中，在20～25℃，避光条件下培养20～30天，即可以从收获细胞中分离到本发明的藏红花素类活性物质。
利用本发明的方法制备的藏红花素类活性物质，可以解决长期以来藏红花资源严重短缺和藏红花价格过高等问题。特别是从藏红花细胞中分离出的藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛或藏红花酸等化学物质具有良好的抗癌活性，具有开发成新型抗癌药物的光明前景，也能够开发成预防肿瘤发生的保健品。还能开发出治疗心脑血管疾病以及咳血、吐血和活血化瘀的良药。
下面介绍本发明的实施例。
实例一(1)在Murashige&Skoog(MS)基本培养基中，按每升培养液加入1.0mg/L细胞生长素奈乙酸和4.0mg/L细胞分裂素卞氨基嘌呤(BA)，再加入20g/L蔗糖，用氢氧化钠或盐酸将其pH值调整到6，加入7g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1MPa压力下消毒后经冷却作成基本培养基；(2)将藏红花的叶鞘用70％的乙醇杀菌1分钟，再用3％的次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在上述基本培养基上，在25℃，黑暗条件下培养40天，形成愈伤组织；(3)重新配制上述基本培养基，在培养基中加入30mg/L细胞分裂抑制剂秋水仙碱，将上述的第二步诱导出的愈伤组织接种在该培养基上，在25℃，避光条件下培养20天；(4)将第三步的愈伤组织细胞放在不加琼脂的液体基本培养基中，在25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养20天，培养出悬浮单细胞系。
(5)将第四步培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板基本培养基上，在25℃，避光条件下培养30天，形成新的细胞团，然后用细胞观察细胞吉氏染色剂(GiemsaStain)染色后，用高倍显微镜(1600倍)观察其染色体数目，挑选出多倍体细胞系；(6)配置基本培养基，并分别加入氨基酸、鸟氨酸10mg/L、诱导子葡萄球菌培养菌液50ml/L、代谢前体番茄烯30mg/L、辅酶NADP10mg/L(从美国希格玛公司购得)，将第五步获得的多倍体细胞系接种在该培养基中，在25℃，避光条件下培养30天，即可以从收获细胞中分离到藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛和藏红花酸类活性物质。
实例二(1)在Gamborg(B5)基本培养基中，按每升培养液加入1.0mg/L2，4-D和4.0mg/L卞氨基嘌呤(BA)，再加入20g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5.8，加入7g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1MPa压力下消毒后经冷却作成基本培养基；(2)将藏红花的叶鞘用70％的乙醇杀菌1分钟，再用3％的次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在上述基本培养基上，在25℃，黑暗条件下培养40天，形成愈伤组织；(3)重新配制上述基本培养基，在培养基中加入50mg/L秋水仙碱，将上述的第二步诱导出的愈伤组织接种在该培养基上，在25℃，避光条件下培养20天；(4)将第三步的愈伤组织细胞放在不加琼脂的基本培养基中(液体)，在25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养20天，培养出悬浮单细胞系。
(5)将第四步培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板基本培养基上，在25℃，避光条件下培养30天，形成新的细胞团，然后用染色剂染色后，用高倍显微镜(1600倍)观察其染色体数目，挑选出多倍体细胞系；(6)配置基本培养基，并分别加入苯丙氨酸10mg/L牙枝枝孢菌培养菌液50ml/L、龙胆二糖30mg/L、NAD10mg/L，将第五步获得的多倍体细胞接种在该培养基中，在25℃，避光条件下培养30天，即可以从收获细胞中分离到藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛和藏红花酸类活性物质。
实例三(1)在White(W)基本培养基中，按每升培养液加入1.0mg/L吲哆乙酸和4.0mg/L卞氨基嘌呤(BA)，再加入20g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5.8，加入7g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过125℃高温，0.1MPa压力下消毒后经冷却作成基本培养基(2)将藏红花的叶鞘用70％的乙醇杀菌1分钟，再用3％的次氯酸钠消毒10分钟，用无菌水冲洗三次后，接种在上述基本培养基上，在25℃，黑暗条件下培养40天，形成愈伤组织；(3)重新配制上述基本培养基，在培养基中加入100mg/L秋水仙碱，将上述的第二步诱导出的愈伤组织接种在该培养基上，在25℃，避光条件下培养20天；(4)将第三步的愈伤组织细胞放在不加琼脂的基本培养基中(液体)，在25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养20天，培养出悬浮单细胞系。
(5)将第四步培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板基本培养基上，在25℃，避光条件下培养30天，形成新的细胞团，然后用染色剂染色后，用高倍显微镜(1600倍)观察其染色体数目，挑选出多倍体细胞系；(6)配置基本培养基，并分别加入色氨酸10mg/L、拟青霉菌培养菌液50ml/L、番茄烯50mg/L、NADP20mg/L，将第五步获得的多倍体细胞接种在该培养基中，在25℃，避光条件下培养30天，即可以从收获细胞中分离到藏红花素、藏红花苦素、藏红花醛和藏红花酸类活性物质。
权利要求
1.一种利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)在常用植物组织培养基中，按每升培养液加入0～10mg/L细胞生长素或0～10mg/L细胞分裂素，再加入20～60g/L蔗糖，用酸或碱将其pH值调整到5～7，加入7～10g/L琼脂，经过加温溶解后，分装在试管中，经过105～125℃高温，0.1～0.15MPa压力下消毒后，经冷却作成基本培养基；(2)将藏红花的叶鞘用70％的乙醇和3％～10％的次氯酸钠消毒后作为外殖体。接种在上述基本培养基上，在20～25℃，黑暗条件下培养20～40天，形成愈伤组织；(3)重新配制上述基本培养基，在培养基中加入细胞分裂抑制剂，加入量为10-100mg/L，将上述的第二步诱导出的愈伤组织接种在该培养基上，在20～25℃，避光条件下培养10～20天；(4)将第三步的愈伤组织细胞放在上述第一步但不加琼脂的基本培养基中，在20～25℃，避光条件下，在90rpm摇瓶机上旋转培养10～20天，培养出悬浮单细胞系；(5)将第四步培养出的悬浮单细胞均匀接种在平板基本培养基上，在20～25℃，避光条件下培养20～30天，形成新的细胞团，然后用染色剂染色后，用高倍显微镜观察其染色体数目，挑选出多倍体细胞系；(6)配置基本培养基，并分别加入氨基酸1～100mg/L、诱导子1～100ml/L、代谢前体10～200mg/L、辅酶0.1～10mg/L，将第五步获得的多倍体细胞接种在该培养基中，在20～25℃，避光条件下培养20～30天，即可以从收获细胞中分离到本发明的藏红花素类活性物质。
全文摘要
本发明涉及一种利用藏红花多倍体细胞培养生产藏红花素类活性物质的方法,首先在培养基中加入细胞生长素、细胞分裂素,再加入蔗糖,用酸或碱调pH值,加入琼脂,成为基本培养基;再将藏红花的叶鞘消毒后作为外殖体。接种在基本培养基上,在培养基中加入细胞分裂抑制剂,培养出悬浮单细胞系;最后加入氨基酸、诱导子、代谢前体和辅酶,即可获得本发明的产品。本发明的产品可以制成新型抗癌药物,也能够制成预防肿瘤发生的保健品。
文档编号A61P35/00GK1267723SQ00102919
公开日2000年9月27日 申请日期2000年3月10日 优先权日2000年3月10日
发明者郭志刚 申请人:清华大学