细胞培养系统和细胞培养方法

细胞培养系统和细胞培养方法
【专利摘要】本发明提供细胞培养系统和细胞培养方法。细胞培养系统具备：细胞培养槽；成分调整液储存槽；培养液成分调整部件，其具有细胞培养液的入口和出口；入口连接送液回路，其自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的入口；出口连接送液回路，其自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的出口；灌注部件，其用于将细胞培养液自入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌注到出口连接送液回路；以及调整部件，其用于调整细胞培养槽的液量，其中，该细胞培养系统能够借助培养液成分调整部件对细胞培养槽内的细胞培养液的成分和成分调整液储存槽内的成分调整液的成分连续地进行调整并能够以使细胞培养槽内的细胞培养液的量为实质上恒定的方式调整细胞培养槽内的细胞培养液的量。
【专利说明】细胞培养系统和细胞培养方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞培养系统和细胞培养方法。

【背景技术】
[0002] 近年来，除了以以往的合成化学物质为主要成分的医药品之外，还广泛应用作为 以使用生物技术生产的生物材料为来源的医药品的生物制剂。在生物制剂之中，尤其引人 注目的是抗体等细胞产物。这些生物制剂的效果非常好，但问题是价格高昂。另外，由于这 些生物制剂是来自生物的产物，因此还存在在制造工序中品质的偏差等大于以往的医药品 的可能性。因此，要求开发用于一次性大量地培养细胞并低廉地制造细胞产物的系统，能够 通过可稳定地保持培养环境并维持细胞的品质的方式来提高细胞产物的品质的培养系统。
[0003]并且，最近，将细胞用于治疗的再生医疗开始实用化。现在，在日本，关于皮肤、软 骨组织方面也存在得到药品批准而在市场销售的产品。现在的治疗方法是，提取患者的一 部分细胞，在使其增殖后制成组织而进行移植，但能够预想到，将来从成体干细胞（somatic stem cell)、多能性干细胞中诱导目标细胞并将其用于治疗的方法会实用化。在要实现这 样的治疗的情况下，为了制作能够向患者移植的大小的组织，需要非常大量的细胞。以心脏 的左心室为例，估算会需要10 a 9个数量级的细胞数。要准备如此大量的培养细胞，凭借 现在的技术手段需要花费大量的工夫和成本。
[0004]并且，现在的细胞培养工序的大部分内容是通过人的手动操作来实施的，因此，不 能完全避免操作错误、细菌等混入到培养系统中的风险。
[0005] 由此，要求实现一种能够以更高的密度培养细胞并能够低成本且自动地实施细胞 培养的有效的培养系统。作为满足这样的要求事项的培养系统，有如下提案：一边利用基于 半透膜的透析原理来连续地净化培养液一边进行培养的各种系统（例如，参照专利文献1、 2。）。
[0006] 但是，在利用这些系统进行细胞培养时，因灌注培养液而产生的半透膜外侧和内 侧的压力差、成分的浓度梯度而使培养液溶剂经由膜进行移动，当实施长时间的培养时，会 使槽内的液量减少或增加而难以控制培养槽内的液量，因此存在难以进行稳定的培养这样 的问题。并且，还存在如下问题，即，通常，在利用这些系统进行培养时，为了减少培养液的 组分变化，要求尽量提高灌注的速度，但越提高灌注速度，越难以进行所述控制。另外，扩大 培养规模也会导致提高灌注速度，从而仍产生相同的问题。
[0007]另外，作为其他方法，在非专利文献1中公开有一种将透析部件连接于转筒型（口 一夕一型）的细胞培养槽的方法。但是，存在这样的培养槽需要为与通常广泛使用的细胞 培养装置不同的特殊的细胞培养槽且难以提升规模这样的问题。
[0008] 专利文献1 :日本特开昭63-226279号公报 [0009]专利文献2:日本特公平7-40928号公报
[0010]非专利文献 I !Biotechnology and Bioengineering，2005 ;92 (7) :920


【发明内容】

[0011] 发明要解决的问是页
[0012] 本发明提供一种用于解决以上所述问题的细胞培养系统。即，本发明的课题在于， 提供一种能够应对各种细胞的培养形态并且能够同时实现低成本、省力化、高密度培养的 系统。
[0013] 用于解决问题的方案
[0014] 本
【发明者】们为了解决所述问题而进行了认真研究，结果发现，能够具有如下特征 的细胞培养系统来提供一种可应对各种细胞的培养形态并且可同时实现低成本、省力化、 高密度培养且可易于实现提升规模的系统，从而完成了本发明，该细胞培养系统的特征在 于，能够借助培养液成分调整部件对细胞培养槽内的细胞培养液的成分和成分调整液储存 槽内的成分调整液的成分连续地进行调整，且能够以使细胞培养槽内的培养液量为实质上 恒定的方式调整细胞培养槽内的培养液量。
[0015] 即，本发明的技术方案提供一种细胞培养系统，其具备：细胞培养槽，其用于培养 细胞；成分调整液储存槽；培养液成分调整部件，其具有细胞培养液和/或成分调整液的入 口和出口，并具有半透膜；入口连接送液回路，其自细胞培养槽和/或成分调整液储存槽连 接到培养液成分调整部件的入口；出口连接送液回路，其自细胞培养槽和/或成分调整液 储存槽连接到培养液成分调整部件的出口；灌注部件，其用于将细胞培养液和/或成分调 整液自入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌注至出口连接送液回路；以及调整部 件，其用于调整细胞培养槽的液量，其中，该细胞培养系统能够借助培养液成分调整部件对 细胞培养槽内的细胞培养液的成分和成分调整液储存槽内的成分调整液的成分连续地进 行调整，并能够以使细胞培养槽内的细胞培养液的量为实质上恒定的方式调整细胞培养槽 内的细胞培养液的量。
[0016]例如，也可以是，在细胞培养系统中，培养液成分调整部件配置在成分调整液储存 槽内，培养液成分调整部件具有细胞培养液的入口和出口，入口连接送液回路自细胞培养 槽连接到培养液成分调整部件的入口，出口连接送液回路自细胞培养槽连接到培养液成分 调整部件的出口，灌注部件将细胞培养液自入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌 注到出口连接送液回路。
[0017] 或者也可以是，在细胞培养系统中，培养液成分调整部件配置在细胞培养槽内，培 养液成分调整部件具有成分调整液的入口和出口，入口连接送液回路自成分调整液储存槽 连接到培养液成分调整部件的入口，出口连接送液回路自成分调整液储存槽连接到培养液 成分调整部件的出口，灌注部件将成分调整液自入口连接送液回路经由培养液成分调整部 件灌注到出口连接送液回路。
[0018]另外，或者也可以是，在细胞培养系统中，相对于成分调整液储存槽和细胞培养槽 而言，培养液成分调整部件设于外部，入口连接送液回路包括第1入口连接送液回路和第2 入口连接送液回路，该第1入口连接送液回路自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的 第1入口，该第2入口连接送液回路自成分调整液储存槽连接到培养液成分调整部件的第2 入口，出口连接送液回路包括第1出口连接送液回路和第2出口连接送液回路，该第1出口 连接送液回路自细胞培养槽连接到培养液成分调整部件的第1出口，该第2出口连接送液 回路自成分调整液储存槽连接到培养液成分调整部件的第2出口，半透膜划分出将第1入 口和第1出口相连接的空间和将第2入口和第2出口相连接的空间，灌注部件包括用于将 细胞培养液自第1入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌注到第1出口连接送液回 路的部件和用于将成分调整液自第2入口连接送液回路经由培养液成分调整部件灌注到 第2出口连接送液回路的部件。
[0019] 也可以是，灌注部件具备：送液部件，其用于将细胞培养槽的细胞培养液和/或成 分调整液储存槽的成分调整液输送到培养液成分调整部件；以及回液部件，其用于使被输 送到培养液成分调整部件，使细胞培养液中的不需要的物质和成分调整液中的有用物质相 接触后的细胞培养液和/或成分调整液返回，送液部件的每小时的送液量Vl和回液部件的 每小时的回液量V2之间满足关系式：0.9XV1 < V2 < I. 1XV1，含有细胞的细胞培养液的 总量的变动在10%以内。
[0020] 也可以是，细胞培养系统还具备过滤件，该过滤件设置在入口连接送液回路上或 第1入口连接送液回路上，用于不使细胞或细胞聚集群通过入口连接送液回路上或第1入 口连接送液回路上位于细胞培养槽内侧的端部,而使细胞培养液实质上通过入口连接送液 回路上或第1入口连接送液回路上位于细胞培养槽内侧的端部。
[0021] 另外，本发明的技术方案提供一种细胞培养方法，该细胞培养方法包括以下步骤： a)设置所述的细胞培养系统，b)向细胞培养槽供给细胞和细胞培养液且向成分调整液储 存槽供给培养液成分调整液，c)连续地灌注细胞培养液和/或成分调整液，在该细胞培养 方法中，对送液部件的每小时的送液量Vl和回液部件的每小时的回液量V2进行控制，使其 满足关系式〇. 9 XVl < V2 < I. IXVl且使含有细胞的细胞培养液的总量的变动在10 %以 内。
[0022] 另外，本发明的另一技术方案提供一种细胞培养系统，该细胞培养系统具备：细胞 培养槽，在该细胞培养槽内至少放入有细胞和细胞培养液，用于培养细胞；成分调整液储存 槽，在该成分调整液储存槽内放入有含有有用物质的成分调整液；培养液成分调整部件， 其用于使细胞培养液和成分调整液相接触而进行物质交换；送液部件，其用于将细胞培养 槽的细胞培养液和/或成分调整液储存槽的成分调整液输送到培养液成分调整部件；以 及回液部件，其用于使细胞培养液和成分调整液相接触后的细胞培养液和/或成分调整液 返回，送液部件的每小时的送液量Vl和回液部件的每小时的回液量V2之间满足关系式： 0. 9XVl < V2 < I. I X VI，细胞培养液的含有细胞的细胞培养液的总量的变动在10%以内。
[0023] 另外或者，本发明的技术方案提供一种细胞培养方法，该细胞培养方法包括以下 工序：培养工序，在该培养工序中，至少将细胞和细胞培养液放入到细胞培养槽内而培养细 胞；送液工序，在该送液工序中，对细胞培养槽的细胞培养液和/或成分调整液储存槽的 成分调整液进行输送；接触工序，在该接触工序中，使细胞培养液和成分调整液经由膜相接 触；以及回液工序，在该回液工序中，使细胞培养液和成分调整液经由膜相接触后的细胞培 养液和/或成分调整液返回，送液工序中的每小时的送液量Vl和回液工序中的每小时的回 液量V2之间满足关系式：0. 9 XVl < V2 < I. IX VI，细胞培养液的含有细胞的细胞培养液 的总量的变动在10%以内。
[0024] 在所述细胞培养系统和细胞培养方法中，例如，细胞是哺乳动物细胞，哺乳动物细 胞是胚胎干细胞（ES细胞）、人造多功能干细胞（iPS细胞）、间充质干细胞、造血干细胞和 /或自以上各种干细胞中诱导分化而成的细胞。
[0025] 在所述细胞培养系统和细胞培养方法中，例如，细胞是能够悬浮培养的细胞、粘着 细胞、形成细胞聚集体的细胞、和/或能够粘着于颗粒状载体的细胞，能够粘着于颗粒状载 体的细胞是通过将细胞和颗粒状载体放入到细胞培养槽内而进行培养。
[0026] 发明的效果
[0027] 本发明的细胞培养系统能够提供一种可应对各种细胞的培养形态且可同时实现 低成本、省力化、高密度培养的系统。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1是表示细胞培养系统的一个例子的示意图，其是表示将培养液成分调整部件 设置在成分调整液槽内的例子的示意图。
[0029] 图2是表示细胞培养系统的一个例子的示意图，其是表示将培养液成分调整部件 设置在成分调整液槽内且将不使细胞通过的过滤件设置在细胞培养槽内的例子的示意图。
[0030] 图3是表示细胞培养系统的一个例子的示意图，其是表示将培养液成分调整部件 设置在细胞培养槽内的例子的示意图。
[0031] 图4是表示细胞培养系统的一个例子的示意图，其是表示将培养液成分调整部件 相对于细胞培养槽和成分调整液储存槽而言独立地设于外部的例子的示意图。
[0032] 图5是表示细胞培养系统的一个例子的示意图，其是表示将培养液成分调整部件 相对于细胞培养槽和成分调整液储存槽而言独立地设于外部，且将不使细胞通过的过滤件 设置在细胞培养槽内的例子的示意图。
[0033] 图6是表示细胞培养槽内细胞培养液的pH变化的图表。
[0034] 图7是表示细胞培养槽内细胞培养液的乳酸浓度变化的图表。
[0035] 图8是表示胚状体（培养第10天）的圆当量直径分布的图表。
[0036] 图9是表示胚状体（培养第10天）中的凋亡（apoptosis)细胞的染色图的图表。

【具体实施方式】
[0037] 下面，说明本发明的实施方式。在以下的附图记载中，以相同或类似的附图标记表 示相同或类似的部分。但是，附图是以示意的方式表示的。因而，具体的尺寸等应当对照以 下的说明进行判断。另外，不言而喻，在附图相互之间也包含相互间的尺寸关系、比例不同 的部分。
[0038] 如图1所示，本实施方式提供一种细胞培养系统，其具备：细胞培养槽1，其用于培 养细胞；成分调整液储存槽2 ;培养液成分调整部件3,其具有细胞培养液9和/或成分调 整液10的入口和出口，并具有半透膜；入口连接送液回路5,其自细胞培养槽1和/或成分 调整液储存槽2连接到培养液成分调整部件3的入口；出口连接送液回路4,其自细胞培养 槽1和/或成分调整液储存槽2连接到培养液成分调整部件3的出口；灌注部件7、6,该灌 注部件7、6用于将细胞培养液9和/或成分调整液10自入口连接送液回路5经由培养液 成分调整部件3灌注到出口连接送液回路4 ;以及调整部件，其用于调整细胞培养槽1的液 量，其中，该细胞培养系统能够借助培养液成分调整部件3对细胞培养槽1内的细胞培养液 9的成分和成分调整液储存槽2内的成分调整液10的成分连续地进行调整，并能够以使细 胞培养槽1内的细胞培养液9的量为实质上恒定的方式调整细胞培养槽1内的细胞培养液 9的量。
[0039] 如图2所示，在细胞培养槽1内，也可以将作为用于防止细胞或细胞聚集群连同细 胞培养液9 一起向细胞培养槽1的外侧渗出的部件的过滤件8设置于入口连接送液回路5 的端部。作为过滤件8,其只要为不易使细胞或细胞聚集群在过滤件表面上发生网眼堵塞的 构造即可，过滤件8的原材料、形状不受限定，例如，若以细胞为对象，则能够使用平均孔径 为5 y m?10 y m的无纺布或由不锈钢、尼龙制成的网格等，另外，若以细胞聚集群为对象， 则能够使用由聚乙烯的烧结体、无纺布制成的平均孔径为30i!m的平板型膜等。在材质具 有容易吸附细胞或细胞聚集群的性质的情况下，也可以利用其它材料涂敷所述材质或使用 表面改性剂来抑制吸附。
[0040] 本实施方式的细胞培养液指的是至少具有各种细胞、能够供各种细胞生长的溶液 成分以及环境的溶液。其成分和浓度根据细胞的性质进行设计。另外，也可以是，以使细胞 培养液具有缓冲能力的方式对细胞培养液进行设计以易于维持生理性pH、向细胞培养液中 混合PH指示色素以易于利用颜色来判别pH的变化。也可以是，原封不动地使用通常市场 销售的各种细胞培养液或根据目标细胞的性质相应地向细胞培养液中添加追加成分后进 行使用。
[0041] 利用本实施方式的细胞培养系统培养的细胞是哺乳动物细胞等细胞。培养的结果 发现，若要利用细胞的产物，还能够选择易于产生目标物质的细胞、为了易于产生目标物质 而导入有特定的基因的细胞。另外，细胞培养的结果发现，若要利用特定的细胞，还能够使 用以易于使特定的细胞增殖的方式改变基因后的细胞等。
[0042] 另外，对于细胞的成熟度也没有任何限制，能够连同成熟细胞、未分化细胞一起使 用。因此，能够例示出从生物体组织经酶处理而提取到的细胞、来自血液的细胞、间充质干 细胞、ES细胞、iPS细胞等。另外，细胞也不限定于粘着细胞、悬浮细胞。并且，细胞也不限 定于单一种类的细胞。也能够使细胞与产生易于使目标细胞生长的物质的其他细胞混合之 后进行共同培养。
[0043]本实施方式的培养液成分调整部件指的是培养液成分的膜透过性取决于培养液 成分的分子量大小的半透性的膜。成分调整液经由培养液成分调整部件与细胞培养液相 接触。培养液成分调整部件的孔径根据欲保持在细胞培养槽内的成分的分子量进行设计。 艮P，以不使欲保持在细胞培养槽内的成分中的最小分子量物质透过膜的方式选择培养液成 分调整部件的孔径。培养液成分调整部件的形状能够为平膜形状、中空纤维形状，但为了灌 注培养液、成分调整液，优选为中空纤维形状。
[0044] 培养液成分调整部件的材质并没有特别限定，但优选使用不使欲保持在细胞培养 槽内的成分发生吸附、分解等的材质。另外，在材质具有吸附欲保持在细胞培养槽内的成分 的性质的情况下，也可以利用其他材料在所述材质上进行涂敷或使用表面改性剂来抑制吸 附。培养液成分调整部件3能够如图3所示那样设置在细胞培养槽1内、或如图1和图2 所示那样设置在成分调整液储存槽2内，或者如图4所示的那样相对于细胞培养槽1、成分 调整液储存槽2而言独立地设于外部。
[0045] 如上所述，本实施方式的细胞培养系统能够至少采用如下3种形态，8卩，1)将培养 液成分调整部件设置在成分调整液槽内，2)将培养液成分调整部件设置在细胞培养槽内， 3)将培养液成分调整部件相对于细胞培养槽和成分调整液储存槽而言独立地设于外部，但 细胞培养系统的形态也能够根据细胞的性质来选择。例如，若所培养的细胞为粘着细胞，则 为了防止细胞附着于设置在细胞培养槽内的培养液成分调整部件的半透膜上而优选使用 1)、3)的形态。另外，若培养细胞为悬浮细胞且是以单个细胞的形式直接增殖的细胞，则优 选使用2)的形态。
[0046] 在图4所示的结构中，被送液部件7自细胞培养槽1抽吸过来的细胞培养液9经 由第1入口连接送液回路5自中空纤维组件的第1入口进入到中空纤维组件的内部，并通 过中空纤维3的内侧而自中空纤维组件的第1出口经由第1出口连接送液回路4返回到细 胞培养槽1。另外，被送液部件15自成分调整液储存槽2抽吸过来的成分调整液10经由第 2入口连接送液回路17自中空纤维组件的第2入口进入到中空纤维组件的内部，并通过中 空纤维3的外侧而自中空纤维组件的第2出口经由第2出口连接送液回路16返回到成分 调整液储存槽2。
[0047] 本实施方式的成分调整液指的是具有细胞培养液的成分之中的能够实质上透过 培养液成分调整部件的成分中的至少一种成分的溶液。对于培养液和成分调整液所分别含 有的成分，能够根据各自的分子量和两液间该成分的浓度差并经由膜来进行调整。
[0048]分子量大于膜的孔径而不能实质上透过膜的成分不在两液间移动。与此相对，对 分子量小于膜的孔径而能够实质上透过膜的成分以使该成分的浓度差变小的方式在两液 间进行浓度调整。通过使由细胞产生的、在细胞培养液中积累的代谢物向成分调整液侧移 动，从而使培养液中代谢物的浓度降低。同时，对于细胞生长所需的、在培养期间培养液中 浓度降低的成分，使该成分自成分调整液向培养液移动而进行补充。根据以上原理，通过适 当地设定成分调整液的组分和浓度，能够维持培养液中的环境，能够维持细胞的良好的生 长环境。当然，也能够原封不动地使用细胞培养液。因此，期望成分调整液具有与在细胞培 养期间自培养液中流失的成分相对应的所有成分，进一步期望的是，对成分调整液中的该 成分的浓度进行设定而不使该成分在培养期间耗尽。
[0049]另外，从防止细胞代谢物的积累的观点考虑，期望尽量较多地设定成分调整液的 量。期望将成分调整液的量设定为培养液的5倍以上，进一步期望将成分调整液的量设定 为培养液的10倍以上。但是，由于成分调整液的量影响培养成本，因此，也可以根据培养期 间和所需细胞数来决定成分调整液的量。另外，也可以是，与细胞培养液同样地以使成分调 整液具有缓冲能力的方式对成分调整液进行设计以易于维持生理性pH、向成分调整液中混 合PH指示色素以易于利用颜色来判别pH的变化。
[0050] 本实施方式的细胞培养槽只要为被设计成能够在保持有各种细胞和具有能够使 各种细胞生长的溶液成分的培养液的情况下直接进行无菌培养的细胞培养槽即可，其形 状、大小、材质不受限定。通常，形状、大小、材质这样的参数根据细胞的特性和需要的细胞 数进行设计。若细胞为粘着细胞，则设计成具有较大的平面构造的细胞培养槽，使得细胞在 重力的作用下沉淀而易于粘着在该槽内表面上，若细胞为悬浮细胞，则设计成具有深度且 通过图1?图4所示那样的旋转翼（搅拌翼）12的搅拌来使培养液的成分、氧浓度易于均 匀化的构造。
[0051] 另外，也可以是，对于粘着细胞，也通过在设计成悬浮细胞用的细胞培养槽内混合 粘着细胞和颗粒状载体而进行培养，从而使粘着细胞粘着于颗粒状载体而一边使粘着于载 体的细胞悬浮一边培养粘着细胞。并且，因悬浮培养而使细胞相互间容易聚合而形成细胞 群那样的粘着细胞也能够利用设计成悬浮细胞用的细胞培养槽进行培养。
[0052] 如图1?图4所示，也可以针对细胞培养槽1设置通气过滤件11。
[0053] 在细胞培养槽上分别设有用于将细胞培养液和/或成分调整液自槽内取出的口 和用于使成分调整后的细胞培养液和/或成分调整液返回到槽内的口。
[0054] 本实施方式的成分调整液储存槽只要设计成能够在培养期间将成分调整液保持 为无菌状态的槽即可，成分调整液储存槽的形状、大小、材质不受限定。通常，形状、大小、材 质这些参数根据成分调整液的量、是否将培养液成分调整部件设置在槽内来适当设计。在 成分调整液储存槽上分别设有用于将细胞培养液和/或成分调整液自槽取出的口和用于 使成分调整后的细胞培养液和/或成分调整液返回到槽内的口。
[0055] 另外，如图1?图4所示，也可以将搅拌转子13放置在成分调整液储存槽2的底 面。并且，也可以针对成分调整液储存槽2设置通气过滤件14。
[0056] 本实施方式的送液回路指的是设置在细胞培养槽、成分调整液储存槽、培养液成 分调整部件这三者之间且具有能够无菌灌注培养液或成分调整液的管腔构造的管。作为该 管的材质，能够使用硅、聚氨酯、氟树脂以及聚氯乙烯等。
[0057] 本实施方式的用于灌注细胞培养液和/或成分调整液的部件指的是以与所述送 液回路相连接的方式设置的、能够使用动力来连续地输送回路内的液体的部件。作为该灌 注部件，能够使用通常的泵，能够例示出蠕动泵、隔膜泵等。
[0058] 本实施方式的用于调整细胞培养槽的液量的部件指的是用于以使细胞培养槽的 液体容量在培养中为实质上恒定的方式调整细胞培养槽的液体容量的部件。也可以使图 1?图4所示的送液部件7、6兼具有这样的功能。在培养装置内设有中空纤维状的半透膜， 当经由该半透膜在培养液与成分调整液之间进行成分的更换或对该半透膜施加过滤压时， 会引起两液相互间的移动。因此，若不采取特别的措置，有时会使最初设定好的培养液和成 分调整液的各自的液量发生变化。并且，当培养液的液量变化时，会使培养液中的成分浓 度、细胞密度发生变化，因此存在不能实现稳定的培养的倾向。因此，例如，通过在半透膜的 入口和出口分别独立地设置泵等送液部件7、6并通过独立地控制所述送液部件7、6,能够 实现将液体容量保持为恒定。也存在利用这样的部件对培养槽、成分调整液储存槽内的空 气层的压力进行控制的方法等，但如所述那样利用至少两台独立的泵来控制液体容量的方 法能够最简单且有效地实施液体容量调整。
[0059] 在图1和图2所示的本实施方式中，例如，送液部件7用于将细胞培养槽1的细胞 培养液9输送到培养液成分调整部件3。送液部件6作为如下回液部件而发挥作用：在借 助半透膜对用于使被输送到培养液成分调整部件3,使细胞培养液9中的不需要的物质和 成分调整液10中的有用物质的浓度进行调整之后，使细胞培养液9返回。
[0060] 在图3所示的本实施方式中，例如，送液部件6用于将成分调整液储存槽2的成分 调整液10输送到培养液成分调整部件3。送液部件7作为用于使被输送到培养液成分调整 部件3的、成分调整液10中的有用物质和细胞培养液9中的不需要的物质相接触后使成分 调整液返回的回液部件而发挥作用。
[0061] 在此，在理想的情况下，期望使送液部件的每小时的送液量Vl和回液部件的每小 时的回液量V2满足关系式Vl = V2,但大多数情况下难以实现完全相等的送液量。另外，虽 然能够使Vl与V2之差非常小，但有时需要价格非常高昂的、精度较高的泵。但是，若使送 液量Vl和V2在0.9 XVl彡V2彡I. IXVl的范围内，则能够在不造成急剧的液量变化的情 况下单独地调整Vl和V2,从而能够易于将所述细胞培养液的总量的变动控制在10%以内， 故此优选。另外，能够通过廉价的泵来容易地实现使送液量Vl和送液量V2在所述范围内。
[0062] 在所述那样使用至少两台独立的泵的情况下，也可以是，如图5所示，还借助信息 传递回路19来随时取得通过使用用于检测细胞培养槽1的液量的部件18而检测到的液面 位于期望高度的上方或位于期望高度的下方时的信息，根据该信息，利用计算机等送液部 件调整器20来使与入口连接送液回路5相连接的泵7的流速和与出口连接送液回路4相 连接的泵6的流速之间具有差，从而构成用于控制细胞培养槽1的液面的系统。例如，即使 在各泵的实际流速与设定值产生了一些误差的情况下，通过构成这样的调整系统，也能够 防止因在长时间的培养中积累误差而使细胞培养槽的液面产生较大的变化。
[0063] 实施例1
[0064] 以下，利用实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不限定于如下实施例。
[0065] 细朐培养系统
[0066] 作为培养装置而使用了八连动动物培养装置Bio Jr. 8 (BJR - 25NA1S - 8C，ABLE Inc.)。本装置能够利用1台控制器控制8台IOOmL容量的细胞培养槽，测定、控制项目是 搅拌速度、温度、pH以及溶解氧浓度（DO)，能够独立地控制各培养槽。
[0067] 准各ES细朐
[0068] 作为培养细胞而选择了小鼠ES细胞（EMG7株）。
[0069] 杯状体培养
[0070] 培养第0天?培养第3天
[0071] 作为细胞培养槽而使用了玻璃制的专用槽（ABLE Inc.)，培养液为100mL。
[0072] 使小鼠ES细胞为密度1X10 a 5cells/mL并开始了培养。将该时刻作为培养第 0天。
[0073] 在Glasgow最少必需培养基（GMEM，Invitrogen Inc.)中添加了以下的成分而将 其作为培养液使用。
[0074] S卩，以如下方式调制培养液：具有10%胎牛血清（FBS，Nichirei Inc. )、0. ImM非 必需氨基酸（NEAA，Invitrogen Inc. )、ImM 丙酮酸钠（Na - pyruvate，Sigma Inc. )、0? ImM 的 2 -疏基乙醇（2-mercaptoethanol) (2 - ME，Invitrogen Inc.)。
[0075] 将该培养液原封不动地培养至第3天，使其形成了作为ES细胞的聚合体的胚状体 (EB :Embryoid body)〇
[0076] 针对细胞培养槽设置了搅拌旋转翼，使搅拌旋转翼的转速为85rpm。
[0077] 针对细胞培养槽设置了能够分别测量温度、pH、溶解氧浓度的传感器。
[0078] 另外，进行了将溶解氧浓度控制为40%的设定，为此，设置了气体导入管线，以便 相对于细胞培养槽内的培养液自上表面通入氧气、氮气、空气的混合气体。并且，设置了用 于将气体自槽排出的导出管线。
[0079] 培养第3天?培养第10天
[0080] 算出了培养到第3天所得到的全部细胞数，如下述那样分成实施例1和比较例的 培养方法而再次开始培养。每个培养槽的细胞密度为1.8X10 a5cells/mL。
[0081] 在实施例1中，制作了图2所示那样的细胞培养系统。即，对于细胞培养槽，在所 述培养槽的盖部分上分别设置了能够取出培养液的口和能够使培养液返回的口。
[0082] 并且，作为用于防止细胞培养槽内的细胞群连同培养液一起向培养槽的外侧渗出 的部件而设置了由聚乙烯的烧结体构成的直径15mm、平均孔径30 y m的平板型膜。
[0083] 作为成分调整液槽而使用了容量IL的玻璃制灭菌瓶。
[0084] 在成分调整液槽的盖的一部分上设置了通气管线、培养液的入口管线以及出口管 线。
[0085] 作为培养液成分调整部件而使用了如下那样构成的部件，即，以使培养液成分 调整部件的有效长度为20cm的方式捆束400根旭化成聚砜膜透析器APS (Asahi Kasei Kuraray Medical Inc.)的中空纤维，并以使中空纤维两端部的管腔构造敞开的方式，利用 聚氨酯粘接剂将中空纤维固定。
[0086] 培养液成分调整部件设置在成分调整液储存部件的内部并利用回路将中空纤维 束的两端部和培养液的入口、出口管线相连接。
[0087] 作为成分调整液而使用了 IL的没有对细胞培养液添加FBS的培养液。
[0088] 作为送液回路而使用了硅制管（内径I miTKp，外径4mm(p )。
[0089] 作为培养液的送液部件而使用了两台IPC - N4(ISMATEC公司）的蠕动泵。两台 泵被设置成分别与用于将细胞培养槽和成分调整液储存槽连接的送液回路相连接而能够 进行送液的状态。
[0090] 根据以上说明的方法制作了图2所示那样的细胞培养系统。
[0091] 关于泵的工作速度，设定为在第3天?第4天期间是IOOmL/每天，在第4天?第 5天期间是400mL/每天，在第5天?第10天期间是IOOOmL/每天。
[0092] 以能够使细胞培养槽的液体容量在实质上为相同水平的方式进行维持的同时对 两台泵流速进行微调，一边连续地灌注培养液一边实施了培养，直到第10天。
[0093] 在第10天结束细胞培养并测定了细胞数。
[0094] 测定细朐数
[0095] 在培养第10天自细胞培养槽回收胚状体，在利用胰蛋白酶浓度为0.25%的胰蛋 白酶/EDTA消化液（Invitrogen Inc.)对胚状体进行处理而使其为单细胞的状态之后，利 用台盼蓝色素将死细胞染色，使用计数板仅对活细胞进行计数。
[0096] 测定乳酸浓度
[0097] 对于培养液中的乳酸浓度的变化，在自细胞培养槽提取少量的培养液之后，使用 多功能生物传感器BF -7 (Oji Scientific Instruments Inc.)测定了乳酸浓度。
[0098] 测定EB的圆当量官径
[0099] 对于EB的圆当量直径，在使用光学显微镜ECLIPSE Ti - U (Nikon Inc.)对EB的 图像进行了拍摄之后，使用图像分析软件（Nikon ElementsD，Nikon Inc.)对EB的外周长 进行测定并根据该外周长的值算出了在为正圆的情况下的圆当量直径。根据各样本对100 个EB的圆当量直径进行测定并制作了圆当量直径的频率分布。
[0100] EB内部细朐的TUNEL染色
[0101] 为了判断EB内部的细胞产生了多大程度的凋亡而进行了 TUNEL染色。
[0102] 由各样本制作了 EB的冰冻切片并使用凋亡检测试剂盒（Takara Bio Inc.)对死 细胞进行了染色。
[0103]比较例I
[0104] 使用培养到第3天的培养装置继续进行培养，直到第10天。
[0105] 第4天和第5天各更换了 1次培养液，在第6天?第9天期间每天各更换了两次 培养液。
[0106] 在更换培养液时使用如下方法，即，在停止细胞培养槽的搅拌而使胚状体沉淀之 后，使细胞培养槽自培养系统装置分离，在洁净台（clean bench)内抽出培养液上清液之 后，添加新鲜的培养液。
[0107] 合计实施了 10次培养液更换，合计使用了 IL的培养液。
[0108] 比较例2
[0109] 使用从实施例1所使用的装置中拆下设置在自成分调整液储存槽连接到细胞培 养槽的送液回路上的泵之后得到的装置继续进行了培养。细胞培养槽内的培养液量随着继 续培养而开始减少，在继续培养变得困难时中止培养。
[oho]MM
[0111] 以下，分别示出培养第10天的实施例1和培养第10天的比较例1的经由培养而 获得的总细胞数。
[0112] 实施例1的总细胞数4.6X10 A 8个
[0113] 比较例1的总细胞数3.4X10 a 8个
[0114] 将培养10天期间的实施例1和培养10天期间的比较例1的培养中的各自的细胞 培养槽的pH变化表示在图6中。
[0115] 将培养10天期间的实施例1和培养10天期间的比较例1的细胞培养槽内细胞培 养液的乳酸浓度变化表示在图7中。
[0116] 根据培养第10天的实施例1和培养第10天的比较例1的培养结果，将获得的EB 的各自的圆当量直径频率分布表示在图8中。
[0117] 根据培养第10天的实施例1和培养10天的比较例1的培养的结果，将获得的EB 的冰冻切片的染色结果表示在图9中。凋亡细胞被染色成茶色。
[0118] 根据以上的结果可知，在实施例的细胞培养系统中，由于不需要更换培养液故能 够将价格高昂的血清的使用量降低到1/10,并且最终回收的细胞数是比较例的大约1.4 倍，能看出显著的差距，因此其是有效的培养方法。另外，可知的是，与比较例相比，在实施 例的培养方法中，乳酸的积累较少，与此相对应地，PH没有降低。并且，确认了如下倾向，即， 实施例培养结束时的EB的直径小于比较例的培养结束时的EB的直径且内部的凋亡细胞较 少。因此，可以认为，在实施例的细胞培养系统中，能够维持良好的培养环境且能够抑制EB 内细胞出现凋亡。
[0119] 实施例2
[0120] 准各ES细朐
[0121] 与实施例1同样地，作为培养细胞而选择了小鼠ES细胞（EMG7株）。
[0122] 杯状体培养
[0123] 培养第0天?培养第3天
[0124] 通过与实施例1的培养第0天?培养第3天相同的方法使用4个细胞培养槽培养 了 ES细胞。
[0125] 培养第3天?培养第10天
[0126] 在实施例2中，制作了图5所示那样的细胞培养系统。即，在培养第3天算出从所 述4个细胞培养槽获得的全部细胞数，以1. 7X 10 a 5CellS/mL的细胞密度收集在1个玻 璃制的大型培养槽（ABLE Inc.)内。使培养液容量为1L。将所述培养槽设于动物细胞培养 装置BCP(BCP - 03NP3S、ABLE Inc.)并开始了培养。
[0127] 作为培养液而使用了与实施例1相同的培养液。
[0128] 针对细胞培养槽设置了搅拌旋转翼，使搅拌旋转翼的转速为60rpm。
[0129] 针对细胞培养槽设置了能够分别测量温度、pH、溶解氧浓度的传感器。
[0130] 另外，进行了将溶解氧浓度控制为40%的设定，为此，设置了气体导入管线，以便 相对于细胞培养槽内的培养液自上表面通入氧气、氮气、空气的混合气体。并且，设置了用 于将气体自槽排出的导出管线。
[0131] 对于细胞培养槽，在所述培养槽的盖部分上分别设置了能够取出培养液的口和能 够使培养液返回的口。
[0132] 并且，作为用于防止细胞培养槽内的细胞群连同培养液一起向培养槽的外侧渗 出的部件，以使该部件浸在培养液的液面中的方式设置了由聚乙烯的烧结体构成的直径 47mm、平均孔径30 ii m的平板型膜。
[0133] 作为成分调整液槽而使用了容量IOL的聚丙烯制罐。
[0134] 在成分调整液槽的盖的一部分上设置了通气管线、培养液的入口管线以及出口管 线。
[0135] 作为培养液成分调整部件而使用了持续缓慢式血液过滤器 Excelf1〇-AEF-〇3(AsahiKaseiKurarayMedicalInc.)〇
[0136] 相对于细胞培养槽、成分调整液储存槽而言，培养液成分调整部件独立地设于外 部。
[0137] 利用回路将培养液成分调整部件和培养液的入口管线相连接而使自细胞培养槽 经所述平板型膜而被取出的培养液在中空纤维内侧流动。接着，利用回路将培养液成分调 整部件和培养液的出口管线相连接而使通过中空纤维内侧后的培养液返回到培养槽。
[0138] 接着，将成分调整液的入口管线、出口管线分别与培养液成分调整部件相连接而 使成分调整液自成分调整液储存槽取出并使其通过培养液成分调整部件的中空纤维外侧 而返回到成分调整液储存槽。
[0139] 作为成分调整液而使用了IOL的没有添加血清的细胞培养液。
[0140]作为送液回路而使用了氟龙管的〇11七1^)(内彳土2111丨119，外径4111131中）。
[0141] 作为培养液的送液部件而使用了3台IPC - MdSMTEC公司）的蠕动泵。3台泵 被设置成分别与两条送液回路相连接而能够进行送液的状态，两条送液回路是将细胞培养 槽和培养液成分调整部件连接的送液回路以及将培养液成分调整部件和成分调整液储存 槽连接的送液回路。
[0142]并且，针对细胞培养槽安装了作为液面检测部件的激光式检测器（基恩士公司）， 将编程好的调整器设置在出口管线1的比送液泵靠细胞培养槽的管线上，以便在引起液面 的上升时使造成液面上升的蠕动泵的流速停止。
[0143]根据以上说明的方法制作了图5所示那样的细胞培养系统。
[0144] 关于泵的工作速度，在第3天?第4天期间，入口管线1的泵为IL/每天，出口管 线泵1的泵为I.IL/每天，在第4天?第5天期间，入口管线1的泵为4L/每天，出口管线 泵1为4. 4L/每天，在第5天?第10天期间，入口管线1的泵为IOL/每天，出口管线1的 泵为IlL/每天。输送成分调整液的泵的工作速度是入口管线1的泵的速度的4倍。
[0145] 以能够利用本系统将细胞培养槽的液体容量在实质上维持在相同水平的方式对 泵流速进行微调，一边连续地灌注培养液一边实施了培养，直到第10天。
[0146] 在第10天结束细胞培养并测定了细胞数。
[0147]
[0148] 以下，分别示出培养第10天的实施例和培养第10天的比较例的经由培养而获得 的总细胞数。
[0149] 实施例2的总细胞数5. 7 X 10 a 9个
[0150] 由以上的结果能够确认，采用实施例的细胞培养系统，易于提升规模。
[0151] 实施例3
[0152] 准各细朐
[0153] 作为培养细胞而选择了市场销售的作为悬浮细胞的CHO细胞（来自于中国仓鼠卵 巢，Life Technologies, Inc.)〇
[0154] 培养第0天?培养第7天
[0155] 在实施例3中，制作了图3所示那样的细胞培养系统。即，作为细胞培养槽而使 用了 "Culstir，，flask(日文名：力夕一）（双臂型且带搅拌组件，柴田科学公 司），使培养液为300mL。
[0156] 使CHO细胞的接种密度为2X10a5cells/mL并开始了培养。将该时刻作为培养 第〇天。
[0157] 作为培养液而使用了⑶一CHO培养基（Life Technologies, Inc.)。
[0158] 针对细胞培养槽设置了搅拌旋转翼，使搅拌旋转翼的转速为80rpm。
[0159] 对于细胞培养槽，在所述培养槽的盖部分上分别设置了能够取出培养液的口和能 够使培养液返回的口。
[0160] 作为成分调整液槽而使用了容量500mL的玻璃制灭菌瓶。
[0161] 在细胞培养槽的盖的一部分上设置了通气管线、成分调整液的入口管线以及出口 管线。
[0162] 作为培养液成分调整部件而使用了如下那样构成的部件，S卩，以使培养液成分调 整部件的有效长度为25cm的方式捆束100根旭化成聚砜透析器APS(AsahiKaseiKuraray MedicalInc.)的中空纤维并以使中空纤维两端部的管腔构造敞开的方式利用聚氨酯粘接 剂将中空纤维固定。
[0163] 培养液成分调整部件设置在细胞培养槽的内部并利用回路将中空纤维束的两端 部和成分调整液的入口、出口管线相连接。
[0164] 作为成分调整液而使用了 300mL的⑶一 CHO培养基。
[0165] 作为送液回路而使用了硅制管（内径lmmq)，外径4mmq))。
[0166]将所述两个槽设置在温度37°C、CO2含量5%的环境下的培养箱（incubator) (IP400,大河科学公司）内。
[0167] 作为成分调整液的送液部件而使用了两台蠕动泵（SJ - 121H，ATTO公司）。两台 泵被设置成分别与用于将细胞培养槽和成分调整液储存槽连接的送液回路相连接而能够 进行送液的状态。
[0168] 根据以上说明的方法制作了图3所示那样的细胞培养系统。
[0169] 关于泵的初始工作速度，在第0天?第4天期间是0. 22mL/分钟，在第4天?第7 天期间是〇. 62mL/分钟。
[0170] 以能够使细胞培养槽的液体容量在实质上为相同水平的方式进行维持的同时对 两台泵流速进行微调，一边连续地灌注培养液一边实施了培养，直到第7天。
[0171] 比较例3
[0172] 使用仅由实施例的细胞培养槽构成的装置（也没有培养液成分调整部件）并与实 施例同样地继续进行了培养，直到第7天。
[0173]
[0174] 以下，分别示出培养第7天的实施例3和培养第7天的比较例3的经由培养而获 得的活细胞的密度。
[0175] 实施例3的细胞密度66. 8X 10 a 5cells/mL
[0176] 比较例3的细胞密度28. 9X10 a 5cells/mL
[0177] 如上所述，能够确认对于以单个细胞的形态增殖的悬浮细胞，实施例的细胞培养 系统也是有效的。
[0178] 产业h的可利用件
[0179] 由于能够提供一种可应对各种哺乳动物细胞的培养形态且可同时实现低成本、省 力化、高密度培养的系统，因此，本实施方式的细胞培养系统和细胞培养方法能够应用于需 要使细胞大量产生蛋白质等产物的领域或大量培养细胞本身而加以利用的领域。
[0180] 附图标记说明
[0181] 1、细胞培养槽；2、成分调整液储存槽；3、培养液成分调整部件；4、送液回路；5、送 液回路；6、送液部件；7、送液部件；8、过滤件；9、细胞培养液；10、成分调整液；11、通气过 滤件；12、搅拌翼；13、搅拌转子；14、通气过滤件；15、送液部件；16、送液回路；17、送液回 路；18、液面检测部件；19、信息传递回路；20、送液部件调整器。
【权利要求】
1. 一种细胞培养系统，其具备： 细胞培养槽，其用于培养细胞； 成分调整液储存槽； 培养液成分调整部件，其具有细胞培养液和/或成分调整液的入口和出口，并具有半 透膜； 入口连接送液回路，其自所述细胞培养槽和/或所述成分调整液储存槽连接到所述培 养液成分调整部件的入口； 出口连接送液回路，其自所述细胞培养槽和/或所述成分调整液储存槽连接到所述培 养液成分调整部件的出口； 灌注部件，其用于将所述细胞培养液和/或所述成分调整液自所述入口连接送液回路 经由所述培养液成分调整部件灌注至所述出口连接送液回路；以及 调整部件，其用于调整所述细胞培养槽的液量，其中， 该细胞培养系统能够借助所述培养液成分调整部件对所述细胞培养槽内的所述细胞 培养液的成分和所述成分调整液储存槽内的所述成分调整液的成分连续地进行调整并能 够以使所述细胞培养槽内的所述细胞培养液的量为实质上恒定的方式调整所述细胞培养 槽内的所述细胞培养液的量。
2. 根据权利要求1所述的细胞培养系统,其中， 培养液成分调整部件为中空纤维状。
3. 根据权利要求1或2所述的细胞培养系统，其中， 所述培养液成分调整部件配置在所述成分调整液储存槽内， 所述培养液成分调整部件具有所述细胞培养液的入口和出口， 所述入口连接送液回路自所述细胞培养槽连接到所述培养液成分调整部件的入口， 所述出口连接送液回路自所述细胞培养槽连接到所述培养液成分调整部件的出口， 所述灌注部件将所述细胞培养液自所述入口连接送液回路经由所述培养液成分调整 部件灌注到所述出口连接送液回路。
4. 根据权利要求1或2所述的细胞培养系统，其中， 所述培养液成分调整部件配置在所述细胞培养槽内， 所述培养液成分调整部件具有所述成分调整液的入口和出口， 所述入口连接送液回路自所述成分调整液储存槽连接到所述培养液成分调整部件的 入口， 所述出口连接送液回路自所述成分调整液储存槽连接到所述培养液成分调整部件的 出口， 所述灌注部件将所述成分调整液自所述入口连接送液回路经由所述培养液成分调整 部件灌注到所述出口连接送液回路。
5. 根据权利要求1或2所述的细胞培养系统，其中， 相对于所述成分调整液储存槽和所述细胞培养槽而言，所述培养液成分调整部件设于 外部， 所述入口连接送液回路包括第1入口连接送液回路和第2入口连接送液回路，该第1 入口连接送液回路自所述细胞培养槽连接到所述培养液成分调整部件的第1入口，该第2 入口连接送液回路自所述成分调整液储存槽连接到所述培养液成分调整部件的第2入口， 所述出口连接送液回路包括第1出口连接送液回路和第2出口连接送液回路，该第1 出口连接送液回路自所述细胞培养槽连接到所述培养液成分调整部件的第1出口，该第2 出口连接送液回路自所述成分调整液储存槽连接到所述培养液成分调整部件的第2出口， 所述半透膜划分出将所述第1入口和所述第1出口相连接的空间和将所述第2入口和 所述第2出口相连接的空间， 所述灌注部件包括用于将所述细胞培养液自所述第1入口连接送液回路经由所述培 养液成分调整部件灌注到所述第1出口连接送液回路的部件和用于将所述成分调整液自 所述第2入口连接送液回路经由所述培养液成分调整部件灌注到所述第2出口连接送液回 路的部件。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养系统，其中， 所述灌注部件具备： 送液部件，其用于将所述细胞培养槽的所述细胞培养液和/或所述成分调整液储存槽 的所述成分调整液输送到所述培养液成分调整部件；以及 回液部件，其用于使被输送到所述培养液成分调整部件，使所述细胞培养液中的不需 要的物质和所述成分调整液中的有用物质相接触后的所述细胞培养液和/或所述成分调 整液返回， 所述送液部件的每小时的送液量Vl和所述回液部件的每小时的回液量V2之间满足关 系式：0· 9XV1 彡 V2 彡 I. 1XV1， 含有所述细胞的所述细胞培养液的总量的变动在10%以内。
7. 根据权利要求3所述的细胞培养系统，其中， 该细胞培养系统还具备过滤件，该过滤件设置在所述入口连接送液回路上，用于不使 细胞或细胞聚集群通过所述入口连接送液回路上位于所述细胞培养槽内侧的端部，而使所 述细胞培养液实质上通过所述入口连接送液回路上位于所述细胞培养槽内侧的端部。
8. 根据权利要求5所述的细胞培养系统，其中， 该细胞培养系统还具备过滤件，该过滤件设置在所述第1入口连接送液回路上，用于 不使细胞或细胞聚集群通过所述第1入口连接送液回路上位于所述细胞培养槽内侧的端 部，而使所述细胞培养液实质上通过所述第1入口连接送液回路上位于所述细胞培养槽内 侧的端部。
9. 一种细胞培养方法，该细胞培养方法包括以下步骤： a) 设置权利要求1?8中任一项所述的细胞培养系统， b) 向所述细胞培养槽供给细胞和所述细胞培养液且向所述成分调整液储存槽供给所 述培养液成分调整液， c) 连续地灌注所述细胞培养液和/或所述成分调整液， 在该细胞培养方法中，对所述送液部件的每小时的送液量Vl和所述回液部件的每小 时的回液量V2进行控制，使其满足关系式0. 9 XVl < V2 < I. I X Vl且使含有所述细胞的 所述细胞培养液的总量的变动在10%以内。
10. -种细胞培养系统，该细胞培养系统具备： 细胞培养槽，在该细胞培养槽内至少放入有细胞和细胞培养液，用于培养所述细胞； 成分调整液储存槽，在该成分调整液储存槽内放入有含有有用物质的成分调整液； 培养液成分调整部件，其用于使所述细胞培养液和所述成分调整液相接触而进行物质 交换； 送液部件，其用于将所述细胞培养槽的所述细胞培养液和/或所述成分调整液储存槽 的所述成分调整液输送到所述培养液成分调整部件；以及 回液部件，其用于使所述细胞培养液和所述成分调整液相接触后的所述细胞培养液和 /或所述成分调整液返回， 所述送液部件的每小时的送液量Vl和所述回液部件的每小时的回液量V2之间满足关 系式：0· 9XV1 彡 V2 彡 I. 1XV1， 细胞培养液的含有所述细胞的所述细胞培养液的总量的变动在10%以内。
11. 一种细胞培养方法，该细胞培养方法包括以下工序： 培养工序，在该培养工序中，至少将细胞和细胞培养液放入到细胞培养槽内而培养所 述细胞； 送液工序，在该送液工序中，对所述细胞培养槽的所述细胞培养液和/或成分调整液 储存槽的所述成分调整液进行输送； 接触工序，在该接触工序中，使所述细胞培养液和所述成分调整液经由膜相接触；以及 回液工序，在该回液工序中，使所述细胞培养液和所述成分调整液经由所述膜相接触 后的细胞培养液和/或成分调整液返回， 所述送液工序中的每小时的送液量Vl和所述回液工序中的每小时的回液量V2之间满 足关系式：〇· 9XV1彡V2彡I. 1XV1， 细胞培养液的含有细胞的所述细胞培养液的总量的变动在10%以内。
12. 根据权利要求1?8、和10中任一项所述的细胞培养系统，其中， 所述细胞是哺乳动物细胞。
13. 根据权利要求12所述的细胞培养系统，其中， 所述哺乳动物细胞是胚胎干细胞（ES细胞）、人造多功能干细胞（iPS细胞）、间充质干 细胞、造血干细胞和/或自以上各种干细胞中诱导分化而成的细胞。
14. 根据权利要求1?8、和10中任一项所述的细胞培养系统，其中， 所述细胞是能够悬浮培养的细胞、粘着细胞、形成细胞聚集体的细胞、和/或能够粘着 于颗粒状载体的细胞。
15. 根据权利要求14所述的细胞培养方法，其中， 所述能够粘着于颗粒状载体的细胞是通过将细胞和颗粒状载体放入到细胞培养槽内 而进行培养。
【文档编号】C12M1/02GK104321419SQ201380022394
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年4月24日 优先权日:2012年4月27日
【发明者】岩元潮, 佐藤美智, 小西佳奈子, 松浦胜久, 清水达也, 冈野光夫 申请人:旭化成株式会社, 学校法人东京女子医科大学