微流体细胞培养系统的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年7月29日提交的题为"微流体室"的美国临时专利序列号61/ 859318和2014年6月18日提交的题为"微流体室"的美国临时专利申请序列号62/013746的 优先权权益。
技术领域
[0003] 本发明设及一种细胞培养系统，更具体地，设及一种用于神经研究的微制造的微 流体培养系统。
【背景技术】
[0004] 生物系统从非常简单变化到极其复杂。在动物与人类的许多神经系统中，神经系 统是协调其自愿和非自愿行动的部分，并且在其身体的不同部分之间传送信号。它包括两 个主要部分，中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)dCNS包含脑和脊髓，而PNS主要包括 神经，它们围成长纤维或轴突束，其将CNS连接到身体的每个其它部分。PNS包括:运动神经 元，调解自愿运动；自主神经系统，包括交感神经系统和副交感神经系统，从而调节非自愿 功能，和肠神经系统，其用于控制胃肠系统。
[000引在细胞水平，神经系统由存在的神经元（也被称为"神经细胞"）限定。神经元具有 特殊结构，使它们能够将信号W沿细纤维(称为轴突)行进的电化学波的形式迅速和精确地 发送到其它细胞，运些细纤维引起化学品（称为神经递质)在结点、突触释放。是神经元之间 的连接形成神经回路，W及是神经网络产生世界的生物体感知并确定其行为。人类的CNS估 计包括大约850亿个神经元，在大脑皮层和小脑之间分裂约20 %和80 %。
[0006] 正如对于许多人类生理系统来说，CNS中的问题可能会对个人出现，导致各种神经 病症，包括但不限于进行性神经性脾骨肌萎缩症、老年痴呆症、帕金森氏病、多发性硬化、重 症肌无力、脱髓銷和轴突变性。在许多情况下，运些神经系统问题出现在老年人中，我们在 过去两百年间增加的寿命已经使运种问题更加明显，并且越来越普遍。即使在1950年至 2010年期间，欧洲和北美的预期寿命从65岁提高到了将近80岁。在亚洲已经从40岁提高到 了将近70岁。据估计，到2050年，在全球范围内每85个人中将有一个人会患上阿尔茨海默氏 症，或者采用联合国对2050年的世界人口估计将会约有1.1亿人患上该病。相比之下，估计 在每300个人中将有一个人患上帕金森病，到2050年又将增加近3000万患者。
[0007] 因此，神经学研究极其重要，W便为患者建立医疗和/或药物治疗方案，来减轻/延 缓其影响，从而对国家健康预算减少财政负担，和/或寻求减少、延迟或移除其对个人的出 现和影响的生活方式、环境、和/或药物因素或调整。解离细胞的培养使得研究人员能够更 具体地描述所研究的神经系统及因此目前许多实验室进行神经元培养。传统上，运些神经 元培养物在培养皿或培养阱内进行，并且已经允许在神经变性疾病比如阿尔茨海默氏病、 亨廷顿氏病、亚急性海绵状脑病等的研究而且在用于理解神经元分化的分子和细胞机理的 发育生物学取得显著研究成果。
[0008] 然而，在运些系统中，神经元连接被随机制成，并且不可能在其中重建类似于在体 内发现的那些的架构。因此，虽然细胞培养方法是一种常用的研究方法来提供生长条件细 胞的系统控制操作，在许多情况下具有神经元、突触和轴突，将整个细胞暴露于相同条件的 主要现有技术方法并不总是有益的。一些细胞可W是不对称的，并且具有专口的区域。例 如，神经元被极化，并且具有在相对长的距离（例如轴突）上延伸的许多过程。因此，在细胞 水平上向研究人员、医生等提供微环境将会是有益的。
[0009] 通过使用微制造过程，在微米级(适于细胞生物学)控制流体和表面特性的能力还 提供了用于调查基本生物过程的新机会。例如，研究人员可能有选择地隔离和治疗细胞的 专业部分或领域。研究人员可W通过图案化技术比如微接触印刷指示神经元附着的位点和 神经突增生的定向和长度。其次，通过将流体隔离域保持在培养区域内，研究人员可W将一 系列正负刺激输送到胞体、轴突或树突。由于神经元代表优异的细胞类型来说明运些概念 并且将作为许多运种实验的基础，所W本发明人因此用它们作为其微制造的微流体细胞培 养概念的实验验证的基础。然而，本领域普通技术人员要认识到的是，根据本发明实施例的 方法和系统将适用于其它类型的细胞或生物类型的应用。
[0010] 因此，本发明的实施例有利地设及一种微制造的微流体细胞系统，其结合了用于 低成本、高容量、占地面积小的系统的微制造技术连同低体积微流体和表面微图案化技术 来创建多室神经元培养设备。微流体正逐渐成为细胞生物学特别是用于神经科学的选择工 具。在Jeon等人的W0/2004/034016"用于神经研究的微流体多隔室装置(Microfluidic Multi-Compartment Device for 化uroscience Research)"和题为。在装置中的相互连接 的隔室之间实现流体隔绝的微流体装置W及方法(A Microfluidic Device for Enabling Fluidic Isolation among Interconnected Compartments within the Apparatus and Methods relating to the same)"的美国专利7419822中；微流体回路结构使得能够将神 经元的胞体与它们的轴突隔离。运些结构由Campenot在"神经生长因子对轴突发展的局部 控审lJ(Local Control of Neurite Development by Nerve Growth Factor)" (Proc. Natl. Acad. Sci.，Vol. 74( 10)，pp. 4516-4519])中从更早的研究得出。虽然适于体外 的中枢神经系统(CNS)的神经元的研究，但该方法依赖于的事实是微通道中的扩散时间很 长，运使得能够分开处理远端和体细胞室。
[0011] 为了在现有技术内解决此，通过施加很容易实现的压力差来提供补偿。例如，将较 大量的液体放入室之一的储存器中W便在不同的室之间产生流体静压力差仅足W。运种现 有技术的实例包括在Jeon等人的题为"(用于实现细胞控制生长的微流体装置^11(3'〇- Fluidic Device for Enabling 1:he Controlled Growth of Cells"的W0/2006/037033中 和题为"(用于实现细胞控制生长的微流体装置W及相关方法)Microfluidic Device for Enabling the Controlled Growth of Cells and Methods Relating to same"的 US2008/0257735中。Viovy等人的题为"(用于细胞培养的装置)Device for Cell CulUire" 的US2011/0306041寻求将运些概念扩展到神经网络和更复杂的结构。根据美国专利 7419822的装置目前在商业上由W聚二甲基硅氧烷(PMDS)制造的Xona微流体提供。
[0012] 然而，运些装置仍然向研究人员表现出局限性，因此本发明的目的特别是为了解 决运些各种限制，并且允许研究、方法和筛选可不采用目前的现有技术装置进行。运些包括 降低制造的复杂性、所需的药物和细胞的量，允许用于神经生物学之外的领域，改进在该装 置的所需微通道区域内的粘合性，与标准显微镜兼容，使得轴突能够生长超过1mm，神经存 活达超过14天的延长时间，允许突触成像，并且采用生物相关的材料包覆结构。
[0013] 对于本领域普通技术人员而言，结合附图并参照本发明的具体实施方案的W下描 述，本发明的其它方面和特征将变得显而易见。
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是减轻与细胞培养系统更具体的是用于神经研究的微制造的微流 体培养系统有关的现有技术中的局限性。
[0015] 根据本发明的实施例，提供了一种微流体装置，包括由微通道连接的第一和第二 隔室，每个隔室包括连接到第一和第二辅助室的主室。
[0016] 根据本发明的实施例，提供了一种制造微流体装置的方法，该微流体装置包括由 微通道连接的第一和第二隔室，每个隔室包括连接到第一和第二辅助室的主室。
[0017] 根据本发明的实施例，提供了 一种培养细胞的方法，包括：
[0018] 提供一种微流体装置，其包括由微通道连接的第一和第二隔室，所述第一和第二 隔室包括主室，所述主室连接到具有所述主室的第一和第二辅助室，其中，
[0019] 至少一个每个主室在沿着主室侧壁的最接近微通道阵列的端壁的每个端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二辅助室，并且在所述角具有相 对于具有微通道的主室的侧壁的高角度；W及
[0020] 至少一个主室具有基本上相对于具有沿其布置的微通道的侧壁的第二侧壁，其 中，所述第二侧壁具有的轮廓选自包括楠圆、抛物线、双曲线、圆、W及预定数学函数中的至 少一个的预定部分的组，并且所述轮廓沿所述微流体装置从其中间至所述第一辅助室在所 述第一辅助室与所述第二辅助室之间的预定点达到其最接近于另一侧壁;W及
[0021 ]将要被培养的细胞引入到所述第一辅助室和所述第二辅助室之一中。
[0022] 根据本发明的实施例，提供了一种执行医疗测试的方法，包括：
[0023] 提供一种微流体装置，其包括由微通道连接的第一和第二隔室，所述第一和第二 隔室包括主室，所述主室连接到具有所述主室的第一和第二辅助室，其中，
[0024] 至少一个每个主室在沿着主室侧壁的最接近微通道阵列的端壁的每个端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二辅助室，并且在所述角具有相 对于具有微通道的主室的侧壁的高角度；W及
[0025] 至少一个主室具有基本上相对于具有沿其布置的微通道的侧壁的第二侧壁，其 中，所述第二侧壁具有的轮廓选自包括楠圆、抛物线、双曲线、圆、W及预定数学函数中的至 少一个的预定部分的组，并且所述轮廓沿所述微流体装置从其中间至所述第一辅助室在所 述第一辅助室与所述第二辅助室之间的预定点达到其最接近于另一侧壁;W及
[0026] 将生物样品引入到所述第一辅助室和所述第二辅助室之一中。
[0027] 根据本发明的实施例，提供了一种微流体装置，包括：
[0028] 第一和第二隔室，每个隔室包括连接到第一和第二辅助室的主室；
[0029] 多个微通道，其互连该对主室，其中，
[0030] 至少一个每个主室在沿着主室侧壁的最接近微通道阵列的端壁的每个端部包括 角，其中，所述主室在所述端壁的其他角具有所述第一和第二辅助室，并且在所述角具有相 对于具有微通道的主室的侧壁的高角度；w及
[0031] 至少一个主室具有基本上相对于具有沿其布置的微通道的侧壁的第二侧壁，其 中，所述第二侧壁具有的轮廓选自包括楠圆、抛物线、双曲线、圆、W及预定数学函数中的至 少一个的预定部分的组，并且所述轮廓沿所述微流体装置从其中间至所述第一辅助室在所 述第一辅助室与所述第二辅助室之间的预定点达到其最接近于另一侧壁。
[0032] 对于本领域普通技术人员而言，结合附图并参照本发明的具体实施方案的W下描 述，本发明的其它方面和特征将变得显而易见。
【附图说明】
[0033] 下面参照附图，仅通过示例，对本发明的实施例进行说明，其中：
[0034] 图1示出了在拆卸根据本发明实施例的微流体室之前和之后W纳米级重现神经元 损伤的体外模型连同解离大鼠 DRG和海马神经元的光学显微镜图像；
[0035] 图2A至2D示出了通过使用在根据本发明实施例的微流体室中生长和培养的轴突 所进行的DRG轴突测量；
[0036] 图3A至3D分别示出了在轴突压缩图3期间聚焦轴突肿胀的逐渐形成和用于海马和 DRG轴突的相应体积变化；
[0037] 图4A至4C示出了在由化学诱导的损伤引起的轴突运输的逐渐损害过程中的FAS的 逐渐形成；
[003引图5A至5B示出了 DRG和海马轴突的弹性；
[0039] 图5C示出了在附连到AFM悬臂的20毫米珠之下的轴突压缩的模型；
[0040] 图6示出了根据本发明实施例的微流体结构的效率；
[0041] 图7示出了根据本发明实施例的设计、单个掩模和装置；
[0042] 图8示意性地示出了将细胞加入根据本发明实施例的微流体结构，示出了壁至通 道相交的设计特点，W增强靠近微通道的细胞保留；
[0043] 图9示出了根据本发明实施例的微流体结构应用至克氏锥虫短膜虫期的分析和对 特定人类蛋白质的吸引；
[0044] 图10示出了具有根据本发明实施例的第一和第二代微流体装置的现有技术微流 体结构；
[004引图11示出了根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置；
[0046] 图12示出了根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置的细胞接种(plate)连同使用 中的该装置的光学显微照片；
[0047] 图13示出了具有染料加载的示意性的被制造的装置；
[0048] 图14和15示出了根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置；
[0049] 图16示出了在初始细胞加载和培养后的根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置 的横截面；
[0050] 图17示出了根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置的横截面，示出了相对于细胞 的各种微通道几何形状；
[0051] 图18示出了根据本发明实施例的第Ξ代微流体装置的透视图，部分组装和组装；
[0052] 图19示出了用于制造主模具且随后模制根据本发明实施例的用于结构的微流体 装置的示例性过程流程；
[0053] 图20示出了根据本发明实施例的微流体装置和排列的培养结构；W及
[0054] 图21和22示出了采用根据本发明实施例的微流体装置和结构生长的培养物的细 胞分析。
【具体实施方式】
[0055] 本发明设及细胞培养系统，更具体地设及用于神经研究的微制造的微流体培养系 统。
[0056] 随后的描述仅提供示例性实施例，且不旨在限制本公开的范围、适用性或配置。相 反，示例性实施例的随后描述将为本领域技术人员提供用于实现示例性实施例的有利描 述。应当理解的是，可W在不脱离由所附权利要求阐述的精神和范围的情况下对元件的功 能和布置进行各种变化。
[0057] A.材料和方法 [005引 A1:微流体室
[0059] 参照图7和10-18,在D部分中对根据本发明实施例的微流体室的设计和讨论进行 描述和示出。
[0060] 用于根据本发明实施例的微流体室的主要部分被制造于McGill Nanotools Microfabrication Facility，并且通过使用聚二甲基硅氧烷（PDMS)制备，使用道康宁 ?Sylgard?l84硅氧烷弹性体套件，例如参见化rk等人的参考文献[7]。将PDMS模式组装到 35毫米玻璃底培养皿上或在涂覆有聚-D-赖氨酸的25毫米玻璃盖玻片上，W便促进细胞的 粘附/附着。
[006。 A2:神经元培养
[0062] 参见参考文献[引和[9]，来自任一性别的大鼠胚胎的海马和DRG神经元被制备，并 加入到微流体室中。通过分别在接种之后Ξ天和八天从DRG和海马培养移除PDMS来拆卸运 些室。由于在通道之间没有物理PDMS屏障，海马和DRG轴突移动并延伸神经突朝向其他轴 突，重塑培养架构并失去并行模式。在DRG培养中，运些变化更加突出，并且在PDMS去除后一 天很明显，而在海马轴突中，在不同通道中生长的轴突之间的接触仅在PDMS去除后3-4天被 观察。为了尽量减少重塑并保持轴突的并联组织在培养物中，DRG神经元W比海马神经元低 四倍的密度被培养，并且在培养中的7-10天内进行测试，而海马轴突在培养中的14-18天之 后进行测试。培养物密度和年龄的运些变化没有导致对采用该模型所施加的损伤的轴突回 应的显著差异。如果指示的话，细胞采用在neurobasal培养基中稀释达1小时的硫酸长春碱 盐（C45也8抓〇9 :此S〇4)处理，洗涂并且立即采用AFM测试，或者采用4 %多聚甲醒固定，用于免 疫组织化学分析或原子力显微镜(AFM)成像。线粒体被巧光标记有MitoTracker?绿色FM和 具有微管追踪器?的微管蛋白。
[0063] A3:免疫细胞化学
[0064] 免疫细胞化学被执行为如在参考文献[引中所述，采用小鼠抗微管蛋白、兔抗神经 丝、兔多克隆抗Tom20(外膜化-145的线粒体前蛋白转位酶）；W及Alexa Fluor?488共辆毒 伞。所用的次级抗体是罗丹明红抗小鼠 IgG和Alexa Fluor?647抗兔IgG。采用在倒置的显微 镜上的60X PlanApo油浸物镜，使用激光扫描共聚焦显微镜对样品成像。
[006引 A4:原子力显微镜(AFM)
[0066] 使用100X物镜（1.45NA)和化电荷禪合器件相机，单轴突的同时压缩和实时成像被 执行在放映机AFM上，其安装在倒置的光学显微镜上。进行两种不同的压缩实验。在第一种 中，参见参考文献[引，20毫米的聚苯乙締珠被固定到氮化娃探针(标称弹黃常数k = 0.01N/ m)的末端，并且，用于采用对于不同时间段的范围为0.1nN^F^4nN的受控力压缩轴突。在 第二种中，标称弹黃常数为k = 0.03N/m的无末端η型娃探针用来施加恒定力到轴突。细胞被 安装到加热级上并且保持在37Γ，恒定的C02供应达实验的持续时间。AFM用来W亚微米精 度定位和按压珠或无末端悬臂到轴突的顶部上。在压缩之前每30秒对培养物的图像进行拍 照达5至10分钟来检测线粒体运动和轴突生存能力，在压缩过程中检测可能表明损伤的轴 突的任何变化，并且在压缩释放之后达10至30分钟W分析轴突恢复。对于模型压缩来说，在 每个轴突上W30秒间隔获取静态模式下的一系列15个力-距离曲线。在数据采集过程中，采 用0.化N的加载力。
[0067] 采用两个不同的仪器在固定的轴突上进行AFM成像，得到类似的结果。为了达到最 好的分辨率并且采用最低的力对最薄的轴突成像，Asylum Research MFP-3D-BI0 AFM安装 至化lympus倒置的