一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞培养基添加剂，特别是涉及一种用于细胞培养基的大豆活性 肽添加剂。
【背景技术】
[0002] 大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆柏为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂，其 蛋白质含量高达90%以上，氨基酸种类近20种，并含有人体必需氨基酸。大豆活性肽是大 豆蛋白质经微生物发酵、酸解或酶解等方法经分离、精制而得到的肽类混合物，其以小分子 肽为主，此外还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆活性肽因其良 好的营养特性、保健特性及加工特性被广泛应用于食品、医药、日用化工等领域。
[0003] 动物细胞是蛋白、病毒的表达载体，细胞的生存状态直接影响其表达量及质量，而 细胞的生长状况由培养基的质量直接决定，因此只有高质量的培养基才能筛选、驯化出优 质的细胞。普通的细胞培养基中通常含有牛血清等动物源成分，然而血清存在安全性风险 高、批间差异大、质量不稳定、成本高等问题，此外血清中还含有一些对细胞产生毒性的物 质以及大分子蛋白，不仅影响细胞的生长，还会增加工业化生产中目的产物分离纯化的难 度，因此含血清的细胞培养基并不适合用于动物细胞大规模培养及抗体、疫苗等生物制品 的制备。
[0004] 自2003年在荷兰召开的题为"改进体外培养技术，替代胎牛血清"的会议号召在 全世界范围内减少血清的使用，在生物药制备、疫苗生产、细胞培养等领域，采用无血清培 养基和无血清培养已成为当今细胞培养领域的一大趋势，而开发适用于动物细胞无血清培 养的优质添加剂显得尤为重要，尤其是非动物源的细胞培养添加剂更加符合当前的发展方 向。
[0005] 以大豆蛋白为原料，采用生物酶水解制得的大豆活性肽来源于植物蛋白，因此避 免了血清等动物性成分中潜在的病毒微生物污染等问题；其制备工艺易于控制，批次间质 量稳定，有利于提高细胞产品生产的稳定性；此外其不含大分子蛋白，有利于细胞产品下游 分离纯化。然而，由于大豆活性肽营养物质丰富，在其加工及储藏过程中易受细菌微生物污 染，进而产生大量细菌内毒素，将其作为细胞培养添加剂使用时会改变细胞形态、破坏细胞 膜结构、诱导细胞凋亡等，对体外培养的细胞生长产生不利影响。除此之外，由于不同的加 工工艺对制备的大豆活性肽产品的组成具有较大影响，而动物血清成分较为复杂，很多成 分至今尚不清楚，因此无法确定某种或某些成分的存在或者缺失是否会对细胞的生长产生 不良影响，从而给大豆活性肽在无血清培养基添加剂上的应用造成一定的困难。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种大豆活性肽添加剂及其应用，该大豆活性肽内毒素含量低，在 作为细胞培养基添加剂应用时，可与多种基础培养基进行复配，用于对多种细胞系进行无 血清培养，并且还能促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物表达。
[0007] 本发明还提供一种用于细胞培养基的大豆活性肽的制备方法，其操作简便，酶解 效率高，并且可将小分子的活性肽与大分子蛋白、细菌内毒素及小分子盐类进行高效地分 离，适合大规模工业化生产。
[0008] 本发明提供的一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，其中分子量小于1000 道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比彡90%，并且所述低聚肽至少包括YE、ERQ、QDPQ、 EGGAH、PQGAR、AAGGSN中的一种或多种。
[0009] 进一步地，所述低聚肽还包括STPH、VGPQ、DVR、GF中的一种或多种。
[0010] 进一步地，所述大豆活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g，特别是内毒素含量 <50EU/g。
[0011] 根据本发明提供的大豆活性肽添加剂，其是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异 性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解后，经分离纯化制得的。
[0012] 本发明所述的非特异性蛋白酶指的是对所作用的底物的特异性低、具有较宽的底 物特异性的一类蛋白酶，如碱性蛋白酶，其可水解多种蛋白质分子的肽链生成多肽或氨基 酸；又如菠萝蛋白酶，其能分解多种蛋白质以及肽、脂和酰胺等。本发明所述的特异性蛋白 酶指的是底物特异性相对严格、仅能作用于蛋白质分子中某些特定肽键的一类蛋白酶，如 羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽键等。
[0013] 在本发明具体方案中，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋 白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种 或两种；特别是，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋 白酶中的两种或两种以上，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶和风味蛋白酶。本发明先采用特 异性蛋白酶对大豆蛋白进行酶解，然后采用非特异性蛋白酶对酶解产物进一步进行酶解， 两者配合使用能够达到较高的酶解效率，并且酶解液中的活性肽、特别是小分子量的活性 肽的含量高。
[0014] 进一步地，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000?6000单位，其中包括 0?1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000单位酶量的碱性蛋白酶、500?2000单位酶 量的中性蛋白酶和0?1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶 的酶量为每克蛋白2000?3000单位，其中包括500?2000单位酶量的羧肽酶和1000? 2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。在本发明中，各蛋白酶的酶活力单位定义为： 在试验条件下，每分钟水解酪蛋白产生lg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位；并且所述 每克蛋白中的蛋白具体指的是大豆分离蛋白中的蛋白，即大豆分离蛋白中每含有1克蛋白 时加入相应单位酶量的各蛋白酶。
[0015] 采用本发明所述非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解，可以 产生多种分子量小于1000道尔顿的低聚肽，本领域技术人员可以根据现有技术中的常规 技术手段从酶解液中分离纯化出所述低聚肽，例如离心、微滤、超滤等。在本发明具体方案 中，所述分离纯化包括离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤中的一种或多种；特别是，本发 明所述分离纯化具体为：对酶解液依次进行离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，其中所述 微滤采用孔径为50?500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100?300道尔顿的 滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000?13000道尔顿的滤膜进行。
[0016] 本发明还提供上述大豆活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。
[0017]进一步地，所述细胞包括CH0细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
[0018] 本发明还提供上述大豆活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/或增强 细胞产物表达上的应用。
[0019] 进一步地，所述细胞选自CH0细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、 MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
[0020] 本发明还提供一种无血清培养基，包括上述任一所述的大豆活性肽添加剂，所述 大豆活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为0. 01?20g/L，优选为1?10g/L，进一 步优选为2?4g/L。
[0021] 本发明还提供上述任一所述的大豆活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：
[0022] 1)首先采用非特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行第一酶解处理，制得第一酶解 液；然后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得大豆蛋白酶解液；
[0023] 2)将所述大豆蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳 滤和超滤，制得大豆活性肽；其中所述微滤采用孔径为50?500nm的滤膜进行，所述纳滤采 用截留分子量为1〇〇?300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000?13000 道尔顿的滤膜进行。
[0024] 根据本发明所提供的制备方法，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000? 6000单位，其中包括0?1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000单位酶量的碱性蛋白酶、 500?2000单位酶量的中性蛋白酶和0?1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所 述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000?3000单位，其中包括500?2000单位酶量的羧 肽酶和1000?2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。本领域技术人员可以根据所 采用的酶的组成来调节所述第一酶解处理和第二酶解处理的条件，如酶解温度和pH值等。
[0025] 进一步地，所述步骤1)具体包括：将大豆分离蛋白与水混合制成蛋白溶液后，以 每克蛋白2000?6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特异性蛋白酶，于40? 60°C下第一酶解处理1. 5?4. 5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000?3000单位的 酶量向所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40?60°C下第二酶解处理2?3小时 后，灭酶，制得大豆蛋白酶解液。所述灭酶可以具体为：将第二酶解处理后的酶解液加热至 85 ?130°C保温 10 ?20min。
[0026] 进一步地，在进行所述第一酶解处理之前还包括：将所述蛋白溶液加热至90? 95°C并保温15?60min，使蛋白溶液中的蛋白变性，有利于后续的酶解处理。
[0027] 根据本发明所提供的制备方法，步骤2)所述离心的转速为4000?12000r/min，所 述离心可以采用碟式分离机进行。
[0028] 根据本发明所提供的制备方法，步骤2)中所述微滤具体包括：先采用孔径为 200?500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第一微滤液，然后采用