一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞培养基添加剂，特别是涉及一种用于细胞培养基的玉米活性 肽添加剂。
【背景技术】
[0002] 培养基是决定体外培养细胞生长代谢的最直接、最重要的环境因素。动物细胞培 养基通常含有血清等动物源添加物，而随着全球疯牛病的流行爆发,血清等动物来源添加 物的使用，给生物制药工业带来感染性海绵状脑病（TSEs)病毒及其它危险物质的安全性风 险骤然上升。全世界的药品监管机构要求药物生产商在制药生产中减少牛源成分的使用， 相关立法机关也越来越反对在制药领域使用牛血清等动物源成分。美国食品及药品管理局 (FDA)和欧洲药品管理局（EMA)严格控制在商业化生产培养基过程中使用动物源成分，以保 证病人最终的服药安全。同时，血清及其他动物源的培养基添加物中含有生长因子、转运蛋 白、贴壁因子、激素等大分子蛋白质，为抗体药物、疫苗等生物制品后期分离纯化带来压力， 最终影响产品得率，增加生产成本。因此，非动物源细胞培养添加物的开发及应用符合当前 的发展方向，目前已成为动物细胞体外培养及生物制药领域的重要课题。
[0003] 玉米黄粉是玉米经湿磨法工艺制得粗淀粉乳，再经蛋白质分离得到麸质水，然后 浓缩干燥制得的，其是玉米湿法加工淀粉时的主要副产物，含有60%以上的蛋白质，还含有 无机盐和多种维生素。玉米活性肽是以玉米黄粉为原料，经预处理、生物酶水解、多级分离 提纯、浓缩干燥等工艺制备出的小分子肽类混合物，其是天然玉米蛋白资源生物加工和转 化利用领域的尖端产品。玉米活性肽来源于植物蛋白，避免了血清等动物性成分中潜在的 病毒微生物污染等问题；其批次间质量一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性；其不含 大分子蛋白，有益于细胞产品下游分离纯化。
[0004] 玉米活性肽营养物质丰富，在其加工及储藏过程中易受细菌微生物污染，进而产 生大量细菌内毒素，将其作为细胞培养添加剂使用时会改变细胞形态、破坏细胞膜结构、诱 导细胞凋亡等，对体外培养的细胞生长产生不利影响。除此之外，由于不同的加工工艺对制 备的玉米活性肽产品的组成具有较大影响，而动物血清成分较为复杂，很多成分至今尚不 清楚，因此无法确定某种或某些成分的存在或者缺失是否会对细胞的生长产生不良影响， 从而给玉米活性肽在无血清培养基添加剂上的应用造成一定的困难。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种玉米活性肽添加剂及其应用，该玉米活性肽内毒素含量低，在 作为细胞培养基添加剂应用时，可与多种基础培养基进行复配，用于对多种细胞系进行无 血清培养，并且还能促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物表达。
[0006] 本发明还提供一种用于细胞培养基的玉米活性肽的制备方法，其操作简便，酶解 效率高，并且可将小分子的活性肽与大分子蛋白、细菌内毒素及小分子盐类进行高效地分 离，适合大规模工业化生产。
[0007] 本发明提供的一种用于细胞培养基的玉米活性肽添加剂，其中分子量小于1000 道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比彡90%，并且所述低聚肽至少包括AP、SAP、PAL、 VNAP、PSSQ、TQPGPQ中的一种或多种。
[0008] 进一步地，所述低聚肽还包括AY、NAP、PVIN、AYPQ中的一种或多种。
[0009] 进一步地，所述玉米活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g，特别是内毒素含量 <50EU/g。
[0010] 根据本发明提供的玉米活性肽添加剂，其是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异 性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解后，经分离纯化制得的。
[0011] 本发明所述的非特异性蛋白酶指的是对所作用的底物的特异性低、具有较宽的底 物特异性的一类蛋白酶，如碱性蛋白酶，其可水解多种蛋白质分子的肽链生成多肽或氨基 酸；又如菠萝蛋白酶，其能分解多种蛋白质以及肽、脂和酰胺等。本发明所述的特异性蛋白 酶指的是底物特异性相对严格、仅能作用于蛋白质分子中某些特定肽键的一类蛋白酶，如 羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽键等。
[0012] 在本发明具体方案中，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋 白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种 或两种；特别是，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋 白酶中的两种或两种以上。本发明先采用特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解，然后采用非 特异性蛋白酶对酶解产物进一步进行酶解，两者配合使用能够达到较高的酶解效率，并且 酶解液中的活性肽、特别是小分子量的活性肽的含量高。
[0013] 进一步地，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000?6000单位，其中包括 0?1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000单位酶量的碱性蛋白酶、500?2000单位酶 量的中性蛋白酶和0?1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶 的酶量为每克蛋白2000?3000单位，其中包括500?2000单位酶量的羧肽酶和1000? 2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。在本发明中，各蛋白酶的酶活力单位定义为： 在试验条件下，每分钟水解酪蛋白产生lg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位；并且所述 每克蛋白中的蛋白具体指的是玉米黄粉中的蛋白，即玉米黄粉中每含有1克蛋白时加入相 应单位酶量的各蛋白酶。
[0014] 采用本发明所述非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对玉米黄粉进行酶解，可以产生 多种分子量小于1000道尔顿的低聚肽，本领域技术人员可以根据现有技术中的常规技术 手段从酶解液中分离纯化出所述低聚肽，例如离心、微滤、超滤等。在本发明具体方案中，所 述分离纯化包括离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤中的一种或多种；特别是，本发明所述 分离纯化具体为：对酶解液依次进行离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，其中所述微滤采 用孔径为50?500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100?300道尔顿的滤膜进 行，所述超滤采用截留分子量为5000?13000道尔顿的滤膜进行。
[0015] 本发明还提供上述玉米活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。
[0016] 进一步地，所述细胞包括CH0细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、 MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
[0017]本发明还提供上述玉米活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/或增强 细胞产物表达上的应用。
[0018]进一步地，所述细胞选自CH0细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、 MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
[0019] 本发明还提供一种无血清培养基，包括上述任一所述的玉米活性肽添加剂，所述 玉米活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为0. 01?20g/L，优选为1?10g/L，进一 步优选为2?4g/L。
[0020] 本发明还提供上述任一所述的玉米活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 1)首先采用非特异性蛋白酶对玉米黄粉进行第一酶解处理，制得第一酶解液；然 后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得玉米蛋白酶解液；
[0022] 2)将所述玉米蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳 滤和超滤，制得玉米活性肽；其中所述微滤采用孔径为50?500nm的滤膜进行，所述纳滤采 用截留分子量为1〇〇?300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000?13000 道尔顿的滤膜进行。
[0023] 根据本发明所提供的制备方法，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000? 6000单位，其中包括0?1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000单位酶量的碱性蛋白酶、 500?2000单位酶量的中性蛋白酶和0?1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所 述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000?3000单位，其中包括500?2000单位酶量的羧 肽酶和1000?2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。本领域技术人员可以根据所 采用的酶的组成来调节所述第一酶解处理和第二酶解处理的条件，如酶解温度和pH值等。
[0024] 进一步地，所述步骤1)具体包括：将玉米黄粉与水混合制成蛋白溶液后，以每克 蛋白2000?6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特异性蛋白酶，于40?60°C下 第一酶解处理1. 5?4. 5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000?3000单位的酶量向 所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40?60°C下第二酶解处理2?3小时后，灭 酶，制得玉米蛋白酶解液。所述灭酶可以具体为：将第二酶解处理后的酶解液加热至85? 13CTC 保温 10 ?20min。
[0025] 进一步地，在进行所述第一酶解处理之前还包括：将所述蛋白溶液加热至90? 95°C并保温15?60min，使蛋白溶液中的蛋白变性，有利于后续的酶解处理。
[0026] 根据本发明所提供的制备方法，步骤2)所述离心的转速为4000?12000r/min，所 述离心可以采用碟式分离机进行。
[0027] 根据本发明所提供的制备方法，步骤2)中所述微滤具体包括：先采用孔径为 200?500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第